三七PnAAE41基因的克隆、表达分析及原核表达

摘要

草酰辅酶A合成酶参与了三七主要止血活性成分三七素的生物合成,研究三七草酰辅酶A合成酶基因(PnAAE41)的分子特征及表达特征,从而完善三七素生物合成途径以及成分积累调控机制等方面的研究.以三七为材料,在前期转录组研究基础上,设计特异性引物,通过RT-PCR扩增获得1个三七AAE基因的cDNA全长.采用生物信息学方法分析其分子特性,通过qRT-PCR技术分析PnAAE41基因的时空表达特异性.通过异源表达探索PnAAE41蛋白最佳的诱导条件,随后以颜色反应作为定性研究的基础.序列分析结果表明,PnAAE41的开放阅读框长度为1572 bp,编码523个氨基酸,登录号为MW242343.系统进化分析显示,PnAAE41蛋白与拟南芥AtAAE蛋白亲缘关系最近.预测PnAAE41蛋白主要定位于细胞质膜上,不含信号肽序列,二级结构中α-螺旋和无规则卷曲占大部分比例.qRT-PCR分析表明,PnAAE41基因主要在根和茎中优势表达.异源表达最佳诱导条件为0.5 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG),16°C诱导9 h,该蛋白对草酸具有催化作用.本研究结果为进一步深入研究AAE在三七素生物合成途径中的功能提供理论基础.