机械法与机械-酶消化法制备大鼠膈肌组织单细胞悬液的比较

摘要

背景:流式细胞术作为目前先进的细胞分析技术,其研究基础是单细胞悬液,但目前尚无有关膈肌组织单细胞悬液制备方法的相关报道。目的:探索应用机械法与机械-酶消化法分别制备大鼠膈肌单细胞悬液的可行性并比较2种方法获得单细胞的数量和活性。方法:以SD大鼠的新鲜膈肌组织为标本,在机械法的基础上,选用胰蛋白酶、胶原酶Ⅰ、胶原酶Ⅱ、胶原酶Ⅳ及其不同组合进行消化制备膈肌单细胞悬液,观察细胞形态并经锥虫蓝染色后测定细胞活性,对活细胞、失活细胞和细胞团块进行计数并计算出细胞存活率和单细胞悬液浓度,结果进行统计学比较分析。结果与结论:①机械-酶消化法所制得的单细胞悬液较机械研磨法细胞分散度好、形态完整、边界清楚、杂质及细胞碎片较少、背景较干净;②单纯机械研磨法制备的单细胞悬液活细胞数较低,失活细胞数较高,细胞存活率最低,团块较多;③在机械法的基础上,加入胰蛋白酶、胶原酶Ⅰ和胶原酶Ⅳ3种等体积混合酶所得单细胞悬液的活细胞数及悬液浓度最高,每0.1 g膈肌组织可获得(1.0-2.0)×106个细胞,细胞存活率较高,与单纯机械法获得单细胞悬液比较,在活细胞、失活细胞、细胞团块、细胞存活率及悬液浓度方面差异均有显著性意义(P<0.05);其次是加入胰蛋白酶和胶原酶Ⅳ这2种等体积混合酶消化法,所得单细胞悬液浓度、细胞成活率及细胞团块方面也均较为理想;④结果表明,机械法和机械-酶消化法均能成功制备出大鼠膈肌单细胞悬液,机械-酶消化法优于单纯机械法,其中加入胰蛋白酶、胶原酶Ⅰ和胶原酶Ⅳ3种等体积混合酶的机械-酶消化法所得单细胞悬液效果最佳,是较优选的膈肌单细胞悬液制作方法。