大鼠抗组胺药敏感性细胞色素P450基因的克隆及其反转录病毒载体的构建和鉴定

摘要

目的:构建反转录病毒表达载体pLXSN-HP450.方法:实验于2004-12/2006-05在广西医科大学生化药理实验室完成.提取正常的Wistar大鼠肝组织的总RNA,反转录-聚合酶链反应技术扩增出抗组胺药敏感性细胞色素P450(HP450)基因.并克隆到pMD18-T载体,经蓝白斑筛选后进行聚合酶链反应,酶切,测序鉴定.BamHI,EcoRI双酶切构建好的重组质粒和反转录病毒载体pLXSN在16℃下经T4连接酶连接过夜,并转化到感受态细胞DH5α,以菌液为模板做聚合酶链反应,结合酶切筛选及鉴定阳性重组反转录病毒载体pLXSN-HP450.结果:反转录-聚合酶链反应扩增出HP450基因.重组质粒pMD18-HP450经双酶切后得到1 461 bp的酶切产物.测序的结果用Clustal W在线与Genebank对比,此目的基因与基因库中的H1基因100%同源.阳性重组载体pLXSN用其菌液聚合酶链反应扩增出目的条带.对重组体pLXSN-HP450进行双酶切得到1 461 bp和5 900 bp两条特异性条带.结论:克隆了HP450基因,并成功构建了重组反转录病毒载体pLXSN-HP450,为进一步研究肝癌的基因治疗奠定了基础.