脑源性神经营养因子对缺氧神经元保护与细胞外信号调节激酶的关系

摘要

背景:有研究者发现激活细胞外信号调节激酶的上游激酶-细胞外信号调节激酶(Extracellular signal-regulated kinase, ERK)途径并没有促神经元存活的作用,还有一些研究者发现激活该信号通路不仅不能对细胞起到保护作用,反而可促进细胞死亡.目的:实验拟观察体外培养神经元急性缺氧损伤中ERK1/2通路在脑源性神经营养因子抗缺氧损伤中的作用.设计、时间及地点:随机对照分组设计,于2005-03/2006-04在华西医院移植工程及移植免疫实验室完成.材料:孕17～19d的SD雌鼠,清洁级,体质量350～400g; ERK1/2特异性阻滞剂U0126购自Calbiochem公司;脑源性神经营养因子购自R&D公司.方法:体外培养孕17～19d的胚鼠大脑皮质神经元,7d后作缺氧培养,并随机分为5组,缺氧组:单纯神经元缺氧培养;脑源性神经营养因子组:缺氧培养前30min加入脑源性神经营养因子50μg/L; U0126组:缺氧培养前1h加入10μmol/L的U0126; U0126+脑源性神经营养因子组:缺氧培养前1h加入10μmol/L的U0126,30min后加入50μg/L脑源性神经营养因子;基线对照组:不做缺氧培养也不加入任何物质.主要观察指标:采用四甲基偶氮唑盐法检测0～8h内各组之间细胞存活率的差别;蛋白免疫印迹检测.0～6h内各组神经元ERK1/2和磷酸化ERK1/2、 cAMP反应元件结合蛋白(cAMP responsive element-binding protein, CREB)和磷酸化CREB的表达变化.结果:①脑源性神经营养因子组神经元活性在缺氧后各时间点显著高于缺氧组(P＜0.01); U0126+脑源性神经营养因子组细胞活性在缺氧后各时间点显著低于脑源性神经营养因子组(P＜0.01).②外源性脑源性神经营养因子对总ERK和总CREB的表达无影响,但可显著增加磷酸化ERK和磷酸化CREB的表达;U0126对总ERK表达无影响,但可显著抑制脑源性神经营养因子作用后磷酸化ERK的上调,同时U0126也可明显抑制脑源性神经营养因子介导的磷酸化CREB的表达.结论:阻滞ERK1/2传递后脑源性神经营养因子对缺氧神经元的保护作用迅速降低,提示ERK1/2是体外培养神经元缺氧损伤中脑源性神经营养因子保护作用的重要途径.