乙酰化肌细胞增强因子2D调节Nur77基因对T细胞凋亡的影响

摘要

目的:Nur77是介导T细胞凋亡的重要基因,它的激活需要第二信使钙离子,而Nur77基因启动子的钙反应元件是转录因子肌细胞增强因子2D的结合位点.探讨在Nur77诱导T细胞凋亡过程中肌细胞增强因子2D是否可以被乙酰化,以及通过调节Nur77基因乙酰化对T细胞凋亡的影响.方法:实验于2006-11/2007-09在吉林大学第一医院血液肿瘤科完成.①材料:大肠杆菌DH5α、pcDNA3质粒由吉林大学第一医院中心研究室保存.pET32M质粒、Flag-p300质粒、pSilencerTM-p300 RNAi质粒由香港科技大学Zhengguo Wu博士馈赠.NFATp质粒由哈佛大学Yun Chen博士馈赠.Jurkat细胞由吉林大学第一医院血液肿瘤科提供.②实验方法:PCR法产生全长的Nur77和依赖Nur77的荧光报告基因被亚克隆到pcDNA质粒中,产生的肌细胞增强因子2D(1-514)、(1-121)、(1-300)、(301-514)各片段以及含4个赖氨酸(K245/K250/K267/K279)位点突变为精氨酸位点的肌细胞增强因子2D (4KR)突变体亚克隆到pcDNA后在氨基端含有Flag抗原簇,于细菌表达载体上进行质粒构建,验证正确的质粒使用脂质体DMRIE-C进行转染.③实验评估:将Nur77荧光报告基因与肌细胞增强因子2D、p300、NFATp共转染到Jurkat细胞中,检测p300对肌细胞增强因子2D促进Nur77转录的影响.免疫沉淀法检测内源性肌细胞增强因子2D是否能够被乙酰化,以及阻滞p300表达后是否影响其乙酰化.体外乙酰化法检测肌细胞增强因子2D的乙酰化位点.荧光素报告分析法检测肌细胞增强因子2D的乙酰化功能缺失对Nur77转录活性的影响.采用流式细胞仪检测其功能缺陷对Nur77诱导T细胞凋亡的影响.结果:①肌细胞增强因子2D与NFATp的二聚体虽然不能促进Nur77的转录,但p300、NFAT、肌细胞增强因子2D的三聚体却能明显促进Nur77的转录,且p300与肌细胞增强因子2D的二聚体也明显促进Nur77的转录.②PMA/Iono活化钙信号传导通路后,肌细胞增强因子2D被乙酰化.当内源性p300RNAi后,p300的表达被阻滞时,肌细胞增强因子2D的乙酰化水平显著下降.③K245,K250,K267,K279氨基酸同时突变可以使肌细胞增强因子2D乙酰化程度大部分丧失,说明在体外这4个赖氨酸位点是肌细胞增强因子2D的主要乙酰化位点.④与空载体比较,转染乙酰化缺陷的肌细胞增强因子2D可使Nur77转录功能提高2.48倍;与转染野生型的肌细胞增强因子2D比较,转染乙酰化缺陷的肌细胞增强因子2D能降低Nur77基因70.4%的转录功能.⑤与空载体比较,Nur77表达能够促进T细胞凋亡,早晚期凋亡之和从4.3%提高至16.3%;共表达野生型肌细胞增强因子2D与Nur77能够进一步促进T细胞的凋亡,早晚期凋亡之和从16.3%提高到31.0%;但肌细胞增强因子2D乙酰化功能缺失的突变体肌细胞增强因子2D明显降低Nur77介导的T细胞凋亡,早晚期凋亡之和从16.3%降低到9.2%.结论:p300对肌细胞增强因子2D促进Nur77的转录起主要作用.肌细胞增强因子2D在Nur77诱导的T细胞凋亡过程中可以被乙酰化,乙酰化的肌细胞增强因子2D通过上调Nur77基因的转录来促进T细胞凋亡.