大鼠骨髓源性血管内皮祖细胞的体外培养与鉴定

摘要

目的：目前内皮祖细胞主要从骨髓、脐带血和外周血获取,但其分离培养方法尚不成熟,外周血来源因损伤小、易获取而被普遍使用,但得到的内皮祖细胞纯度较低。实验拟探讨大鼠骨髓来源内皮祖细胞体外培养、诱导扩增和生物学特性鉴定方法。方法：实验于2006-08/2007-08在南昌大学第一附属医院泌外研究所完成。①实验材料：2周龄SD大鼠由南昌大学医学院动科部提供,雌雄不拘,清洁级,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法：应用梯度离心法采集大鼠骨髓单个核细胞,贴壁筛选法分离内皮祖细胞,置于添加了血管内皮细胞生长因子、人碱性成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子、表皮生长因子的M199培养液中扩增培养,对培养2周的细胞采用免疫荧光染色鉴定细胞标志物血管性血友病因子、血管内皮生长因子受体-2、CD34、CD133,采用RT-PCR法检测内皮细胞特异性分子标志血管性血友病因子、FLK-1、Tie-2、CD34、CD133、eNOS基因表达。结果：①培养4d,光电显微镜下可见细胞集落形成,梭形贴壁细胞从集落中央以放射状向外周生长。培养7-10d,细胞集落相互连接,呈典型的＂鹅卵石＂样外观。2周左右可见细胞排列成条索状结构并可呈“微血管样”排列生长。②贴壁细胞免疫荧光染色鉴定细胞标志物血管性血友病因子、FLK-1、CD34、CD133阳性,RT-PCR法检测内皮细胞特异性分子标志血管性血友病因子、FLK-1、Tie-2、CD34、CD133、eNOS基因阳性表达。结论：采用梯度离心法从骨髓中分离单个核细胞,经诱导培养可实现内皮祖细胞的分离培养和体外扩增。