炎症微环境下线粒体融合蛋白2及其介导的内质网-线粒体偶联对牙周膜干细胞成骨分化能力的影响

摘要

目的探讨内质网与线粒体偶联及线粒体融合蛋白（mitofusion2,Mfn2）对牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells,PDLSC）成骨分化能力的影响,为促进牙周炎患者牙周组织再生提供理论基础和治疗靶点。方法刮取正常及牙周炎牙齿（由第四军医大学口腔医学院口腔颌面外科门诊收集）的牙周膜组织,用原代和有限稀释法单克隆化培养健康来源的（health,H）PDLSC（H-PDLSC）及炎症来源的（periodontitis,P）PDLSC（P-PDLSC）,透射电镜及细胞器特异性荧光染色检测内质网-线粒体偶联水平;实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qPCR）检测两种来源PDLSC中Mfn2的表达差异;用肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor alpha,TNF-α）模拟炎症微环境,分别应用正常培养基及含5、10 mg/L TNF-α的培养基培养H-PDLSC,设为H-PDLSC组、H-PDLSC+TNF-α（5 mg/L）组和H-PDLSC+TNF-α（10 mg/L）组,培养7 d后qPCR检测Mfn2表达水平;通过小干扰RNA Mfn2（siMfn2）下调P-PDLSC中Mfn2的表达,成骨诱导液培养7 d后qPCR检测成骨因子的表达差异,培养28 d后茜素红染色及氯化十六烷基吡啶定量检测各组矿化结节形成差异。结果透射电镜下观察内质网与线粒体偶联结构,与H-PDLSC组（偶联长度/线粒体周长为0.23±0.07、偶联长度/内质网周长为0.18±0.05）相比,P-PDLSC组中内质网线粒体偶联水平显著增加（偶联长度/线粒体周长为0.55±0.10、偶联长度/内质网周长为0.44±0.08）（P＜0.01）;特异性荧光染色检测内质网与线粒体共定位显示,P-PDLSC组内质网与线粒体共定位系数（0.71±0.09）显著高于H-PDLSC组（0.40±0.10）（P＜0.01）。P-PDLSG组Mfn2表达量（1.46±0.10）显著高于H-PDLSC组（0.99±0.08）（P＜0.01）;H-PDLSC+TNF-α（5 mg/L）组及H-PDLSC+TNF-α（10 mg/L）组Mfn2表达量均显著高于H-PDLSC组（P＜0.01）。成骨诱导7 d qPCR结果显示,P-PDLSC+siMfn2组碱性磷酸酶、Runt相关转录因子2及骨钙蛋白mRNA表达量均显著高于对照组（P＜0.01）,28 d茜素红染色及氯化十六烷基吡啶定量结果与qPCR结果一致。结论炎症微环境下PDLSC的内质网-线粒体偶联增加,线粒体融合蛋白Mfn2表达量升高导致PDLSC成骨分化能力下降,其具体机制还需进一步研究。