狼源产气荚膜梭菌的分离鉴定及分子分型

摘要

为探究黑龙江省某动物园狼急性死亡病例的病原菌及其生物学特性,本研究采集病死狼心血、肝、脾及颌下淋巴结样品,经细菌分离纯化,结果显示,上述样品接种鲜血琼脂培养基厌氧培养24 h后可见灰白色、双层溶血环的菌落,在强化梭菌培养基上形成黑色圆形菌落;革兰染色镜检可见单个或呈短链状排列的革兰阳性粗大杆菌。通过生化试验和16S rRNA基因的PCR扩增及序列分析对分离菌进行鉴定,并进一步经PCR扩增确定分离菌的毒素型。生化试验结果显示,分离菌能发酵葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖,且还原性硝酸盐试验、明胶液化和牛奶爆裂发酵均呈阳性,且无运动性;16S rRNA基因、毒素基因的PCR扩增和遗传进化分析结果表明分离菌为A型产气荚膜梭菌,命名为HLJ15-2。经多序列位点分型分析(MLST)确定分离菌的ST型,结果显示分离菌为ST 221型,属于鸡源菌。采用K-B纸片扩散法对分离菌进行药敏试验,结果显示该菌对氟苯尼考、头孢呋辛钠、头孢噻肟等磺胺类和喹诺酮类抗菌药敏感。小鼠分别经腹腔接种10倍倍比稀释(5.21×10^(5) cfu/mL~1.52×10^(9) cfu/mL)的HLJ15-2菌液,计算该菌对小鼠的半数致死量(LD_(50)),采集病死小鼠肝、脾、肠进行组织病理学观察分析分离菌对小鼠的致病性,结果显示分离菌LD_(50)为2.26×10^(7) cfu/mL,剖检小鼠可见肝脏、脾脏均有出血,肠道膨隆,肠黏膜充血,组织病理切片观察可见肝内各级血管淤血,肝细胞条锁状排列消失,胞浆内出现大小不等的空泡;脾脏红髓比例增加,白髓部分细胞坏死;肠绒毛断裂,黏膜固有层上皮细胞增生、黏膜下层红细胞增多、充血、炎性细胞浸润。本研究首次报道了致病性A型产气荚膜梭菌可感染狼,并导致其急性死亡,为野生动物梭菌性传染病的诊断与防控提供参考。