绵羊肺炎支原体P113蛋白和丝状支原体山羊亚种LppA蛋白共表达质粒对小鼠免疫应答的研究

摘要

为研究绵羊肺炎支原体(Mo)P113基因和丝状支原体山羊亚种(Mmc)LppA基因的共表达质粒免疫小鼠后对其免疫系统的影响,本研究构建了真核重组质粒pVAX1-P113-LppA,并经PCR、双酶切及测序鉴定正确后转染MDBK细胞,利用PCR及间接免疫荧光试验(IFA)分别检测P113蛋白和LppA蛋白的表达,结果显示,正确构建了含Mo P113基因及Mmc LppA基因的重组质粒pVAX1-P113-LppA;且该重组质粒在MDBK细胞中能有效转录并表达目的蛋白。分别在0、7 d、14 d时以100μg/只pVAX1-P113-LppA腿部肌肉注射免疫BABL/c小鼠,并设Elution Buffer对照组和空载体pVAX1(100μg)对照组,通过MTT法检测小鼠脾细胞增殖情况,并在初次免疫后28 d利用流式细胞术分析各组小鼠脾细胞中CD4^(+)T淋巴细胞和CD8^(+)T淋巴细胞所占总淋巴细胞数的变化,同时采用的ELISA方法检测小鼠免疫后血清特异性抗体和细胞因子(IL-2、IL-4和IFN-γ)的分泌情况。结果显示,重组质粒组小鼠脾淋巴细胞增殖能力极显著高于对照组和空载体组(P<0.01),且该组小鼠脾CD4^(+)、CD8^(+)T淋巴细胞在免疫28 d时较Elution Buffer对照组和空载体pVAX1(100μg)对照组均极显著上升(P<0.01);该组小鼠免疫后7 d的血清特异性抗体水平极显著升高(P<0.01),在初次免疫后第49 d特异性抗体仍为阳性;血清中IL-2、IL-4和IFN-γ的分泌水平较Elution Buffer对照组和空载体pVAX1(100μg)对照组均呈显著上升趋势(P<0.05),且在首次免疫后28 d时分泌量最高,而后缓慢下降。攻毒试验结果显示,重组质粒pVAX1-P113-LppA对小鼠具有一定的免疫保护能力,小鼠肺部病理损伤明显减轻,发病数量减少。本实验首次表明重组质粒pVAX1-P113-LppA能诱导小鼠产生体液免疫和细胞免疫应答,Mo P113基因和Mmc LppA基因可以作为羊支原体肺炎(MPSG)DNA疫苗的候选基因,该结果为MPSG核酸疫苗的研究与应用提供实验基础。