丝状支原体山羊亚种膜蛋白的组成与免疫原性研究

摘要

山羊传染性胸膜肺炎(CCPP)，是山羊特有的急性或慢性高度接触性传染病。感染该病的山羊常常引起胸腔的病变，临床上以高热、咳嗽、呼吸道哕音、卡他性鼻液、眼结膜炎、纤维素性胸膜炎、肺炎以及部分母羊流产、进行性消瘦为主要特点。它被世界动物卫生组织(OIE)列为B类传染病。古典的山羊传染性胸膜肺炎病原是山羊支原体山羊肺炎亚种(Mccp)，原称生物型F38。它属于丝状支原体簇，该簇共有六个成员，除了Mccp外，还包括：山羊支原体山羊亚种(Mcc)；丝状支原体丝状亚种SC型(MmmSC)；丝状支原体丝状亚种LC型(MmmLC)；丝状支原体山羊亚种(Mmc)；牛支原体第七群(Mbg7)。从目前的报道来看，我国的CCPP病原主要包括：山羊支原体山羊肺炎亚种(Mccp)、丝状支原体山羊亚种(Mmc)、绵羊肺炎支原体(MO)、丝状支原体丝状亚种SC型(MmmSC)等。本试验旨在对重庆分离到的CCPP病原进行分子生物学方面的鉴定及对其膜蛋白的组成及免疫原性进行初步研究，建立有效的分子生物学方法，为对重庆山羊传染性胸膜肺炎的流行病学调查以及进一步研制亚单位疫苗或诊断抗原等后续研究提供理论基础。 首先根据支原体的高度保守序列16S rRNA及MmmLC和Mmc的脂蛋白LppA序列设计了两对引物，对CCPP的病原重庆分离株进行鉴定。采用饱和酚抽提方法制备目的菌株基因组DNA，优化PCR反应体系后进行PCR扩增。结果两对引物均扩增出了目的条带，而对照组没有扩增出条带。此反应体系具有较强的特异性，检测下限可达10ng/mL DNA。因此初步将山羊传染性胸膜肺炎病原重庆分离株鉴定为丝状支原体山羊亚种。 其次是对丝状支原体山羊亚种重庆分离株的膜蛋白组成和免疫原性进行研究，以明确菌体中具有免疫原性的膜蛋白片段，找出保护性抗原片段，为防制该病提供理论依据。采用超声波将菌体破碎之后再用去垢剂SLs将膜蛋白释放出来，进而采用梯度超速离心将膜蛋白沉淀下来。膜蛋白经SDS-PAGE分析以确定膜蛋白的组成，采用考染和银染两种方法对胶块进行染色。结果表明：PG3的膜蛋白分子量范围在99.7kDa-15.4 kDa之间，共有11条带，分子量分别为：99.7kDa，81.9 kDa，75.1 kDa，65.6 kDa，57.4kDa，51.1kDa，27.8kDa，25.2 kDa，20.1 kDa，16.8 kDa，15.4kDa；而三株分离株的膜蛋白条带基本相同，分子量范围均在100.6kDa-17.1 kDa之间，共有13条带，分别为：100.6 kDa，94.5 kDa，81.3 kDa，75.4 kDa，72.7 kDa，65.1 kDa，62.4 kDa，51.3 kDa，48.0 kDa，33.2 kDa，25.1 kDa，20.1 kDa，17.1 kDa。分离株之间的膜蛋白成份没有明显差异，而分离株与标准株的膜蛋白组成基本相同，两者有四条相同的条带：81.9 kDa，75.1 kDa，65.6 kDa和51.1kDa。所提取的膜蛋白还用于免疫印迹和淋巴细胞增殖试验。将膜蛋白定量与佐剂充分乳化后免疫家兔，制备抗血清。当琼扩效价达到1：16时即采血分离血清，采用饱和硫酸铵法纯化IgG，用于免疫印迹反应。同时，在免疫后隔周采血分离血清，采用间接ELISA测定免疫后7周内的抗体效价，并绘制抗体消长曲线图。结果表明，各个菌株均在免疫一周后产生了特异性抗体，效价为1：400.1：800：而在三免后效价均达到了最高点，为1:6400-1:12800，此后效价开始下降，在两周内效价维持在1:3200-1:6400水平，而在免疫后第六周效价下降得更快。说明抗体效价与免疫时间、免疫次数呈正相关。首免后隔周外周采血，肝素钠抗凝并加入等量淋巴细胞分离液分离淋巴细胞。采用MTT法测定淋巴细胞转化率(LTR)。试验组加入适量膜蛋白使其终浓度为500βg/mL，对照组加入等量的DMEM完全培养基：于培养结束前4h加入MTF，培养结束后，加入50％DMF-20％SDS裂解液，稍加振荡后避光放置1h；测定OD560并根据公式计算淋巴细胞转化率。结果表明：PG3及分离株膜蛋白均能明显刺激淋巴细胞体外增殖，表明试验家兔对该膜蛋白具有特异性免疫反应，从而提示了膜蛋白具有较强的免疫原性。 用纯化的IgG和所提取的膜蛋白进行免疫印迹。首先将纯化后的膜蛋白抗原与阴性血清进行免疫印迹，消除非特异性反应。每一菌株均首先与其自身膜蛋白抗血清反应，以寻找出能刺激机体产生抗体的膜蛋白片段。然后将标准株与分离株的膜蛋白抗原、抗血清进行交叉反应，以证明标准株与分离株之间是否存在共同的具有免疫原性的蛋白质片段。结果表明：PG3株与其自身膜蛋白抗血清反应时，出现了四条颜色较深的条带，分子量大小分别为：94.5kDa，65.6 kDa，62.5 kDa，.53.0 kDa。而当抗PG3血清与分离株抗原反应时，在65.6 kDa和53.0 kDa处存在交叉反应。分离株膜蛋白抗原与自身膜蛋白抗血清反应时，同样出现了四条颜色较深的条带，分别是：101.4 kDa，84.9 kDa，62.5 kDa，53.0 kDa。而当PG3膜蛋白抗原分别与抗各分离株膜蛋白血清交叉反应时，同样出现了两条颜色较深的条带，位置分别是65.6kDa和53.0 kDa，说明两者之间存在共同的具有免疫原性的蛋白质片段，而分离株之间的具有免疫原性的蛋白质片段没有差异。

目录

文摘

英文文摘

声明

第1章文献综述

1.1支原体概述

1.2山羊传染性胸膜肺炎的流行概况

1.3支原体病的诊断及支原体的鉴定方法

1.4支原体的致病机理及其膜蛋白免疫原性

1.5山羊的传染性胸膜肺炎的防制

第2章引言

第3章丝状支原体山羊亚种的PCR鉴定

3.1材料

3.2方法

3.3结果与分析

3.4结论与讨论

第4章Mmc膜蛋白的提取及SDS-PAGE分析

4.1材料

4.2方法

4.3结果与分析

4.4结论与讨论

第5章Mmc膜蛋白的免疫原性初步研究

5.1材料

5.2方法

5.3结果与分析

5.4结论与讨论

参考文献

附录:英文缩略词一览表

致谢

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