山羊支原体山羊肺炎亚种的分离鉴定及膜蛋白抗体间接血凝检测方法的建立

摘要

山羊支原体山羊肺炎亚种属于“丝状支原体簇”的六成员之一，是典型山羊传染性胸膜肺炎的唯一病原。1976年Macowan和Minette于肯尼亚首次从发病山羊体内分离到该病原并验证了其致病性。山羊传染性胸膜肺炎是山羊特有的急性或慢性高度接触性传染病,以呈现纤维素性肺炎和胸膜炎为特征,在非洲、亚洲等数十个国家和地区都有流行，对山羊养殖业的带来了较为严重的损失，被世界动物卫生组织列为法定传染病之一，但由于其病原营养要求苛刻，分离培养困难等因素，目前只有14个国家分离到该病原。我国对山羊传染性胸膜肺炎的报道始于上世纪20年代，但迄今为止仅辛九庆等于2007年从山东分离到一株山羊支原体山羊肺炎亚种。
　　本实验从内蒙古地区某养殖场采集症状典型发病羊病料108份，无菌剪碎、研磨组织并接种到支原体选择性培养基中，通过对液体培养基颜色和固体菌落的观察选择疑似山羊传染性胸膜肺炎病原，并反复传代纯化病原。将分离到的山羊传染性胸膜肺炎疑似病原通过染色镜检、生化鉴定、血清学等方法进行初步鉴定。然后将符合山羊肺炎支原体山羊亚种的菌株，参照已知的丝状支原体16SrRNA的序列设计一对可扩增1500bp片段的通用引物进行PCR扩增，将电泳条带胶回收后测序。最后参照已知山羊支原体山羊肺炎亚种特异arcD基因设计的引物进行PCR扩增，以此来区分丝状支原体簇的不同株。测序结果显示所测序列与丝状支原体簇的同源性在89.1％~99.1%不等。该结果确定了所得病原为丝状支原体簇的某一成员。而用ArcD基因设计的特异引物，经PCR检测到316bp的条带，与文献报道相一致，最终确定该病原为山羊支原体山羊肺炎亚种。
　　采用TritonX-100提取Mccp膜蛋白作为抗原，致敏醛化鞣酸化的绵羊红细细胞，与山羊支原体山羊肺炎亚种高免兔血清，山羊支原体阳性血清进行间接血凝实验。结果显示该方法有一定的特异性和良好的敏感性。并对内蒙地区某羊场132只山羊进行检测，阳性率为12%。为该地区的山羊支原体山羊肺炎亚种的血清学诊断及流行病学调查提供了依据。

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1 引言

1.1 山羊传染性胸膜肺炎的研究进展

1.2 本研究的目的和意义

1.3 试验主要内容

2 Mccp的分离培养与鉴定

2.1 实验材料

2.2 试验方法

2.3 实验结果

2.4 讨论

3 膜蛋白抗原间接血清学诊断实验

3.1 材料与方法

4 全文结论

致谢

参考文献

附录

作 者 简 介