鸡毒支原体SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

摘要

为建立鸡毒支原体(MG)的快速定量检测方法,本研究根据GenBank中登录的MG 16S rDNA基因序列设计了一对引物,以MG基因组DNA为模板扩增其16S rDNA基因片段,并克隆于pMD 18-T载体中,以纯化的重组质粒作为标准品建立了MG SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法.结果表明,该方法在1.96×108拷贝/μL～1.96× 102拷贝/μL范围内线性关系良好,相关系数为0.999;最低检测限可达1.96× 101拷贝/μL;与禽类其它呼吸道病原无交叉反应,特异性良好;批内及批间变异系数均低于2％,具有较高的重复性和稳定性.采用该方法抽检30份疑似临床样品,检出率为40％,敏感性明显高于常规PCR (33％)和血清平板凝集试验方法(23％),检测活疫苗可达到精确定量每头份2.0×107拷贝/μL.该研究为MG的早期诊断与净化、疫苗质量监测提供了一种新的快速定量检测技术.