SYBR Green Ⅰ

摘要： Class Ⅱ Transactivator(CIITA)作为重要的MHCⅡ类分子反式激活因子在抗原递呈细胞的成熟和功能实现过程中发挥关键作用,为建立一种快速检测猪源CIITA基因的方法,本研究根据GenBank中猪源CIITA基因序列设计引物,从猪肺泡巨噬细胞的总cDNA中扩增CIITA基因,并克隆到pCold-TF载体中获得重组质粒pCold-TF-CIITA。利用重组质粒pCold-TF-CIITA作为标准品建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法。试验结果显示:该方法在1.68×10^(1)~1.68×10^(7) copies/μL范围内呈现出良好的线性关系,检测灵敏度可达16.8 copies/μL,组内和组间变异系数均小于1%。利用该方法对不同细胞中的CIITA基因进行检测,结果显示该方法仅能够检测到猪源细胞中的CIITA基因。本试验结果表明,利用pCold-TF-CIITA作为标准品建立的CIITA基因SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可用于CIITA基因的定量检测。

摘要： 为了建立一种能快速、灵敏且准确检测鹅出血性多瘤病毒(goose hemorrhagic polyomavirus,GHPV)的诊断方法,将GHPV的VP1基因构建到载体pClone007 Blunt Simple Vector上,将获得的重组质粒作为标准阳性模板,以建立GHPV VP1基因的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性、重复性和在临床检测中的应用进行验证。结果显示,所建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的标准曲线呈良好的线性关系,其线性相关系数R^(2)=0.975,其扩增效率E=86.731%,熔解曲线呈现单峰;检测鹅细小病毒、鹅圆环病毒、鹅副黏病毒、鸭坦布苏病毒、鹅星状病毒时呈阴性,具有较好的特异性;最低检出浓度为(1.16×10^(1)copies/μL),比普通PCR方法灵敏100倍;其中组内变异系数在0.10%~1.48%之间,组间变异系数在1.07%~2.24%之间,具有较好的重复性和稳定性;对20份临床组织样品检测结果进行分析发现,与普通PCR检测结果相比阳性率高出20%,其中阳性符合率为100%,总符合率为80%。上述结果表明,本研究建立的检测GHPV的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,对GHPV的快速诊断和监测具有重要意义。

摘要： 为深入研究塞内卡病毒A的病原学及流行病学,本研究分离获得了1株塞内卡病毒A的重庆地区毒株并将其命名为SVA-XN2021。针对VP1基因,设计了1对特异性引物,将SVA-XN2021株编码区克隆入载体pcDNA3.1(+),构建了以重组标准阳性质粒pcDNA3.1(+)-SVA为模板的SVA的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,并进行了特异性、敏感性和重复性试验。结果显示,本研究建立的荧光定量PCR检测方法的Ct值与标准品模板在1.0×10^(1)~1.0×10^(6)copies/μL的范围内线性关系良好,相关系数为0.9948。且用该方法对PEDV、TGEV、PDCoV等猪常见的腹泻病样品检测时无扩增,表明其特异性良好;该方法检测下限可达到1.0×10^(1)copies/μL,比常规RT-PCR敏感性高10倍;组内变异系数介于0.1%~0.29%之间,组间变异系数介于0.1%~0.81%之间,说明该检测方法重复性较好。上述结果表明,本研究建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法可以作为SVA的重要诊断技术,有利于SVA的防治。

摘要： 本研究旨在建立一种快速、灵敏的用于诊断水泡性口炎的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测方法。通过RT-PCR分别扩增印第安纳型水泡性口炎病毒(VSV-IN)和新泽西型水泡性口炎病毒(VSVNJ)的G基因,然后将其连接到克隆载体pMD19-T上,构建质粒标准品pMD-VSV-IN-G和pMD-VSV-NJG。根据GenBank中VSV-IN和VSV-NJ的G基因保守序列设计引物,利用SYBR GreenⅠ法进行实时荧光定量RT-PCR,建立标准曲线,并进行特异性、敏感性和重复性试验。结果,在拷贝数6.82~6.82×10^(8)copies/μL范围内,C;值与质粒拷贝数的对数值呈良好的线性关系,pMD-VSV-IN-G标准曲线的R;值为0.99812,p MD-VSV-NJ-G标准曲线的R^(2)值为0.99748;检测其他病毒均无特异性扩增曲线,特异性良好。pMD-VSVIN-G的检测灵敏度为6.82 copies/μL,pMD-VSV-NJ-G的检测灵敏度也为6.82 copies/μL,是普通RTPCR方法的10倍。用该方法对实验室保存的VSV-IN和VSV-NJ各5份攻毒小鼠样品进行检测,检测结果与普通RT-PCR检测一致。上述结果表明,本检测方法的建立对快速、灵敏鉴别诊断IN型和NJ型水泡性口炎病毒具有重要的应用价值。

摘要： 目的建立一种灵敏、特异的柯萨奇B组3型(CV-B3)病原SYBR GreenⅠRT-PCR实时荧光定量检测方法,用于快速、准确地检测CV-B3。方法设计柯萨奇B组病毒通用引物以及VP1基因的T7启动子特异性引物,以体外转录获得的RNA为标准品,绘制标准曲线,建立CV-B3的荧光定量PCR检测方法;对检测方法的敏感度、特异性、重复性进行评价。结果该检测方法在10~10^(9)拷贝/微升范围内具有良好的扩增效率和线性关系,最低检测限为10拷贝/微升,标准曲线r^(2)=0.999,扩增效率为95.7%;且对柯萨奇病毒A组6型(CV-A6)、柯萨奇病毒A组10型(CV-A10)、肠道病毒71型(EV-71)均无交叉反应,重复性实验变异系数(CV%)<2%。结论本实验建立的检测方法敏感度较高,同时具备良好的特异性及重复性,可用于CV-B3病原的临床及实验室样本的定性定量检测。

摘要： 为建立检测美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的荧光定量PCR方法,在本实验室前期试验筛选到扩增效果相对最好的3对引物(扩增基因区域对应ORF6)的基础上,本研究以PRRSV CH-1R株cDNA作为模板,利用这3对引物进行PCR扩增,将扩增产物克隆至pMD18-T载体,构建3个重组质粒标准品。采用方阵法对荧光定量PCR反应条件优化,最终建立了3对引物的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法。结果显示,标准曲线Ct值均与相应质粒标准品浓度存在良好的线性关系,相关系数(R~2)分别为0.992、0.999、0.999;该方法除对美洲型PRRSV有特异性扩增外,对猪圆环病毒2型(PCV2)、伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、欧洲型PRRSV等病原的基因组DNA或cDNA均无扩增,特异性强;对3种质粒标准品的检测下限均为1.228×10^(1)拷贝/μL,敏感性高;组内与组间重复性试验变异系数均小于2%,重复性较好。利用该方法检测6份经预检的PRRS临床样品,3对引物的阳性检出率均为100%,与国标荧光定量PCR方法检出率相当,高于常规PCR(50%、50%和83.3%)的阳性检出率。尽管该方法的3对引物和国标方法均能检出,但部分样品不同引物检测的Ct值有差异。本研究通过利用多对引物并提高引物覆盖面,可减少因引物结合位点突变引起的检测不准确问题,3对引物中,若有1对引物检测样品的结果呈阳性,则该样品判为阳性样品,本研究为PRRSV的快速和定量检测提供了思路和方法。

摘要： 骨形态发生蛋白15(bone morphogenetic protein 15,BMP15)基因突变对绵羊排卵率、产仔数以及繁殖力有很大影响,本研究旨在建立快速可视化检测BMP 15基因B2突变的技术.将改良的扩增阻滞突变系统(amplification refractory mutation system,ARMS)与核酸染料SYBR GreenⅠ结合,针对BMP 15基因B2突变设计ARMS特异性引物,使引物下游3'端的最后一个碱基为A,并在下游引物3'端的第3位碱基处设计额外的错配,以提高引物的特异性;经ARMS PCR扩增后,向产物中加入SYBR GreenⅠ,通过肉眼观察PCR管内的颜色变化来检测BMP 15基因的B2突变.经测序发现所采集的样本均为野生型,因此,利用重叠延伸PCR构建BMP 15基因B2突变型模板,测序结果显示BMP 15基因B2突变型模板构建成功.ARMS PCR结果显示,ARMS特异性引物能够只扩增突变型模板,而不会扩增野生型模板,且扩增效果良好.ARMS PCR扩增后加入SYBR GreenⅠ发现已知野生型模板与阴性对照一致,呈SYBR GreenⅠ原始颜色橙黄色,而已知突变型模板呈亮绿色,且色差明显,肉眼可辨.用建立的可视化检测BMP 15基因B2突变的技术检测50个小尾寒羊基因组DNA(随机向其中20个样本中加入构建的BMP 15基因B2突变型模板),将可视化检测的突变型样本编号与混合样本时记录的编号对比,结果表明该技术能够准确检测绵羊BMP 15基因的B2突变,且准确率高达100％.将构建的BMP 15基因B2突变型的模板进行梯度稀释,对本试验可视化检测体系的灵敏度进行检测,发现ARMS可视化检测技术的灵敏度达到0.006 ng/μL.因此,本研究建立的技术能够可视化地检测绵羊BMP 15基因B2突变,且准确率高,有望为高繁殖力绵羊的选育提供技术支持.

摘要： 为建立快速、灵敏、特异的检测羊口疮病毒(ORFV)的方法,基于羊口疮病毒保守序列B2L基因合成一对用于建立SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR的特异性引物,将ORFV B2L全长基因和pMD19-T质粒载体连接,构建重组阳性质粒,以构建的重组质粒DNA作为模板,建立ORFV SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法.结果显示:所建立的ORFV SYBR Green I实时荧光定量PCR方法线性关系良好,重复性好,扩增效率高,无引物二聚体和非特异性扩增,最低检测限为2.13×101 copies/μL,比普通PCR高出1000倍,该方法对绵羊羊痘病毒和山羊痘病毒的核酸cDNA不检出,特异性好;对180份山羊全血样本进行ORFV检测,结果得出常规PCR阳性检出率为2.8％(5/180),荧光定量PCR阳性检出率为4.4％(8/180).试验表明,本次建立的ORFV SYBR Green I实时荧光定量PCR方法特异性强、敏感度高、重复性好,适用于羊口疮病毒临床样本的检测.

摘要： 为了建立鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus,AngHV)的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法,利用PCR扩增出AngHV ORF49的序列,克隆至pET-32a载体,构建重组质粒pET-32a-ORF49,作为qPCR的标准品;根据ORF49序列设计引物,以梯度稀释的质粒标准品为模板,进行SYBR Green Ⅰ qPCR扩增,制作标准曲线,建立AngHV的qPCR检测方法,并评价其灵敏性、特异性、重复性和应用效果.结果 显示,qPCR的阈值循环数(cycle threshold value,CT)与标准品的拷贝数线性关系良好,且线性范围广,获得的标准曲线相关系数(R2)达到0.999,扩增效率为100.855％;该方法特异性好,可特异性检测AngHV,而对鲤疱疹病毒Ⅲ型(Cyprinid herpesvirus 3,CyHV-3)、蛙虹彩病毒(Rana grylio virus,RGV)和鳗鲡虹彩病毒(Eel iridovirus,EIV)无扩增;该方法重复性强,组内和组间变异系数分别小于1％和2％;该方法灵敏性高于普通PCR法,最低可检测到10个病毒拷贝,而普通PCR法为1000个病毒拷贝.qPCR检测发现,在感染AngHV的欧洲鳗鲡主要组织内均可检测到AngHV,并且鳃、鳍和皮肤黏液内的病毒量显著高于其他组织;对保存的25份疑似鳗鲡"脱黏败血综合征"病料进行检测,阳性检出率为96％,而普通PCR法的阳性检出率仅为76％.本研究建立的AngHV SYBR GreenⅠ qPCR检测方法灵敏性高、特异性强、重复性好,可用于AngHV的快速和定量检测,对鳗鲡"脱黏败血综合征"的防控也具有重要意义.

摘要： 为建立检测盖他病毒(GETV)的敏感、特异且快速的方法,本研究根据GETVE1基因的保守区域设计引物,通过反应条件的优化,建立了快速检测GETV的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法.利用该方法对GETV以及临床猪常见病毒(PRRSV、PCV2、PRV、JEV、PTV、PSV)进行检测,结果显示该方法仅对GETV检测为阳性,而对其他病原均无特异性扩增,特异性强;以10倍倍比稀释后的质粒标准品pMD19-CETV为模板,采用该方法进行敏感性检测,结果显示本实验建立的该方法最低检测下限为6.87拷贝/μL,是常规RT-PCR方法的10倍,敏感性高;以不同稀释度的质粒标准品作为模板进行组内和组间的重复性试验,结果显示该方法组内和组间变异系数均小于1.5％,重复性好.利用该方法对35份临床流产死胎的猪脑组织样品进行检测,结果显示所有样品均未检出GETV,与普通RT-PCR方法检测结果一致.本研究首次建立的GETV SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR方法具有特异性强、敏感性高、重复性好的特点,可应用于对GETV的检测.

摘要： 目的：在参考前人的基础上建立检测PPV vp 2基SYBR GreenⅠ实时PCR方法，研究PPV的体外复制规律，为疫苗的研制提供技术和理论依据。方法：根据己经发表的猪细小病毒(PPV)的vp 2基因序列，设计一对特异性引物，建立检测PPV的SYBR GreenⅠ实时PCR方法。利用该方法对PPV在体外感染PK-15细胞上的复制动态进行研究。结果：细胞外病毒量在接毒初始的36h逐渐下降，随后开始逐步增加。108h之后随着细胞的大量死亡，细胞内、外病毒数量都开始急剧减少。结论：荧光PCR更加适合用于病毒的快速、特异定量检测，从而了解病毒体外增殖的动态规律。

摘要： 目的：在参考前人的基础上建立检测PPV vp 2基SYBR GreenⅠ实时PCR方法，研究PPV的体外复制规律，为疫苗的研制提供技术和理论依据。方法：根据己经发表的猪细小病毒(PPV)的vp 2基因序列，设计一对特异性引物，建立检测PPV的SYBR GreenⅠ实时PCR方法。利用该方法对PPV在体外感染PK-15细胞上的复制动态进行研究。结果：细胞外病毒量在接毒初始的36h逐渐下降，随后开始逐步增加。108h之后随着细胞的大量死亡，细胞内、外病毒数量都开始急剧减少。结论：荧光PCR更加适合用于病毒的快速、特异定量检测，从而了解病毒体外增殖的动态规律。

摘要： 目的：在参考前人的基础上建立检测PPV vp 2基SYBR GreenⅠ实时PCR方法，研究PPV的体外复制规律，为疫苗的研制提供技术和理论依据。方法：根据己经发表的猪细小病毒(PPV)的vp 2基因序列，设计一对特异性引物，建立检测PPV的SYBR GreenⅠ实时PCR方法。利用该方法对PPV在体外感染PK-15细胞上的复制动态进行研究。结果：细胞外病毒量在接毒初始的36h逐渐下降，随后开始逐步增加。108h之后随着细胞的大量死亡，细胞内、外病毒数量都开始急剧减少。结论：荧光PCR更加适合用于病毒的快速、特异定量检测，从而了解病毒体外增殖的动态规律。

摘要： 目的：在参考前人的基础上建立检测PPV vp 2基SYBR GreenⅠ实时PCR方法，研究PPV的体外复制规律，为疫苗的研制提供技术和理论依据。方法：根据己经发表的猪细小病毒(PPV)的vp 2基因序列，设计一对特异性引物，建立检测PPV的SYBR GreenⅠ实时PCR方法。利用该方法对PPV在体外感染PK-15细胞上的复制动态进行研究。结果：细胞外病毒量在接毒初始的36h逐渐下降，随后开始逐步增加。108h之后随着细胞的大量死亡，细胞内、外病毒数量都开始急剧减少。结论：荧光PCR更加适合用于病毒的快速、特异定量检测，从而了解病毒体外增殖的动态规律。

摘要： 紫花苜蓿的秋眠与光敏色素基因的表达紧密相关，实时逆转录聚合酶链反应(FQ—PCR)是研究基因表达时空变化最直接和准确的方法之一。为了建立一种快速、灵敏检测紫花苜蓿PHYA和PHYB基因mRNA表达水平的反应体系，本研究提取紫花苜蓿叶片总RNA，PCR扩增Actin、PHYA和PHYB基因片段，将其克隆入pMD18-T载体进行测序。基于SYBRGreen Ⅰ双链嵌合染料建立检测紫花苜蓿PHYA和PHYB基因mRNA表达水平方法，对PCR产物的熔解曲线进行分析评价其特异性，经测序鉴定目的片段已插入pMDl8-T载体内，重组质粒的构建非常成功。为验证其准确性，我们检测紫花苜蓿WL-232 PHYA、PHYB mRNA表达量，结果证明：所建立的测定PHYA和PHYB基因mRNA水平的方法准确，适用于紫花苜蓿的各种组织的大量样本检测。

摘要： 紫花苜蓿的秋眠与光敏色素基因的表达紧密相关，实时逆转录聚合酶链反应(FQ—PCR)是研究基因表达时空变化最直接和准确的方法之一。为了建立一种快速、灵敏检测紫花苜蓿PHYA和PHYB基因mRNA表达水平的反应体系，本研究提取紫花苜蓿叶片总RNA，PCR扩增Actin、PHYA和PHYB基因片段，将其克隆入pMD18-T载体进行测序。基于SYBRGreen Ⅰ双链嵌合染料建立检测紫花苜蓿PHYA和PHYB基因mRNA表达水平方法，对PCR产物的熔解曲线进行分析评价其特异性，经测序鉴定目的片段已插入pMDl8-T载体内，重组质粒的构建非常成功。为验证其准确性，我们检测紫花苜蓿WL-232 PHYA、PHYB mRNA表达量，结果证明：所建立的测定PHYA和PHYB基因mRNA水平的方法准确，适用于紫花苜蓿的各种组织的大量样本检测。

摘要： 紫花苜蓿的秋眠与光敏色素基因的表达紧密相关，实时逆转录聚合酶链反应(FQ—PCR)是研究基因表达时空变化最直接和准确的方法之一。为了建立一种快速、灵敏检测紫花苜蓿PHYA和PHYB基因mRNA表达水平的反应体系，本研究提取紫花苜蓿叶片总RNA，PCR扩增Actin、PHYA和PHYB基因片段，将其克隆入pMD18-T载体进行测序。基于SYBRGreen Ⅰ双链嵌合染料建立检测紫花苜蓿PHYA和PHYB基因mRNA表达水平方法，对PCR产物的熔解曲线进行分析评价其特异性，经测序鉴定目的片段已插入pMDl8-T载体内，重组质粒的构建非常成功。为验证其准确性，我们检测紫花苜蓿WL-232 PHYA、PHYB mRNA表达量，结果证明：所建立的测定PHYA和PHYB基因mRNA水平的方法准确，适用于紫花苜蓿的各种组织的大量样本检测。

摘要： 紫花苜蓿的秋眠与光敏色素基因的表达紧密相关，实时逆转录聚合酶链反应(FQ—PCR)是研究基因表达时空变化最直接和准确的方法之一。为了建立一种快速、灵敏检测紫花苜蓿PHYA和PHYB基因mRNA表达水平的反应体系，本研究提取紫花苜蓿叶片总RNA，PCR扩增Actin、PHYA和PHYB基因片段，将其克隆入pMD18-T载体进行测序。基于SYBRGreen Ⅰ双链嵌合染料建立检测紫花苜蓿PHYA和PHYB基因mRNA表达水平方法，对PCR产物的熔解曲线进行分析评价其特异性，经测序鉴定目的片段已插入pMDl8-T载体内，重组质粒的构建非常成功。为验证其准确性，我们检测紫花苜蓿WL-232 PHYA、PHYB mRNA表达量，结果证明：所建立的测定PHYA和PHYB基因mRNA水平的方法准确，适用于紫花苜蓿的各种组织的大量样本检测。

摘要： 紫花苜蓿的秋眠与光敏色素基因的表达紧密相关，实时逆转录聚合酶链反应(FQ—PCR)是研究基因表达时空变化最直接和准确的方法之一。为了建立一种快速、灵敏检测紫花苜蓿PHYA和PHYB基因mRNA表达水平的反应体系，本研究提取紫花苜蓿叶片总RNA，PCR扩增Actin、PHYA和PHYB基因片段，将其克隆入pMD18-T载体进行测序。基于SYBRGreen Ⅰ双链嵌合染料建立检测紫花苜蓿PHYA和PHYB基因mRNA表达水平方法，对PCR产物的熔解曲线进行分析评价其特异性，经测序鉴定目的片段已插入pMDl8-T载体内，重组质粒的构建非常成功。为验证其准确性，我们检测紫花苜蓿WL-232 PHYA、PHYB mRNA表达量，结果证明：所建立的测定PHYA和PHYB基因mRNA水平的方法准确，适用于紫花苜蓿的各种组织的大量样本检测。

摘要： 紫花苜蓿的秋眠与光敏色素基因的表达紧密相关，实时逆转录聚合酶链反应(FQ—PCR)是研究基因表达时空变化最直接和准确的方法之一。为了建立一种快速、灵敏检测紫花苜蓿PHYA和PHYB基因mRNA表达水平的反应体系，本研究提取紫花苜蓿叶片总RNA，PCR扩增Actin、PHYA和PHYB基因片段，将其克隆入pMD18-T载体进行测序。基于SYBRGreen Ⅰ双链嵌合染料建立检测紫花苜蓿PHYA和PHYB基因mRNA表达水平方法，对PCR产物的熔解曲线进行分析评价其特异性，经测序鉴定目的片段已插入pMDl8-T载体内，重组质粒的构建非常成功。为验证其准确性，我们检测紫花苜蓿WL-232 PHYA、PHYB mRNA表达量，结果证明：所建立的测定PHYA和PHYB基因mRNA水平的方法准确，适用于紫花苜蓿的各种组织的大量样本检测。