猪脑心肌炎病毒HB10株cDNA感染性克隆的构建

摘要

为建立猪脑心肌炎病毒(EMCV) HB10株cDNA感染性克隆,本研究利用反向遗传操作技术,采用RT-PCR一次性扩增EMCV-HB 10株全长基因组(包括5’和3'UTR)序列,并直接克隆于低拷贝载体pOK12中,构建了EMCV感染性重组质粒pOK12-EMCV-HB 10.将重组质粒体外转录后转染BHK-21细胞进行病毒拯救.结果显示,转染细胞36 h后,出现典型的细胞病变.拯救病毒rEMCV-HB 10全基因组经测序鉴定显示,与亲本病毒开放阅读框比较,其仅在1D基因出现两个核苷酸突变:即A37G (R13K)和G187C (M63I),该突变可以作为区别亲本病毒的标志.间接免疫荧光和生长曲线试验结果显示,这两个突变并不影响VP1蛋白的表达及病毒拯救,并且拯救病毒与亲本病毒具有相似的生长特性.本研究构建了感染性EMCV-HB 10 cDNA克隆,为深入研究EMCV的致病分子机理提供了有效的反向遗传操作平台.