脑心肌炎病毒HB10株感染性cDNA克隆的构建及其应用

摘要

猪脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus，EMCV)宿主范围广，可以感染啮齿类动物、猪、大象和非灵长类动物等。有报道称人也可以被感染。EMCV是一个无囊膜的单股正链RNA病毒，属于小RNA病毒科，心病毒属。EMCV基因组全长约7.8kb，含一个开放阅读框(openreading fragment，ORF)，ORF的两边为5'和3'UTR（非翻译区）。5'UTR含有一个介导病毒多聚蛋白起始合成的内部核糖体介入位点（internal ribosome entry site，IRES）和一个poly(C)结构;3'UTR末端含有一个poly(A)尾巴。病毒的基因组编码一个多聚蛋白前体，在3C蛋白酶的参与下裂解为P1，P2，和P3，但是首次裂解发生在蛋白的复制的延伸过程，早于3C蛋白酶的形成，裂解点位于2A和2B蛋白之间，由NPG(P)基序介导。
　　本研究旨在利用反向遗传操作技术建立EMCV-HB10株的cDNA感染性克隆。采用RT-PCR方法，一次性扩增出EMCV-HB10株全长基因组（包括5'和3'UTR）序列，并直接克隆到低拷贝载体pOK12中，构建含有全长EMCV HB10基因组的重组质粒(pEMCV-C9)。该重组质粒经酶切线性化，体外转录为RNA。将转录产物转染BHK-21细胞中进行拯救病毒。转染细胞36h后，出现典型的细胞病变（cell pathogenic effect，CPE）。拯救病命名为rEMCV-C9并经RT-PCR扩增并全基因组测序鉴定。5' UTR序列比对显示，拯救病毒含有9bp的poly(C)，而亲本病毒的poly(C)结构为C7TCTC3TC10，长度为24 bp。该差别可以作为区别亲本病毒EMCV-HB10和拯救病毒rEMCV-C9的一个基因标志。除poly(C)的长度外其余序列均与亲本病毒一致。间接免疫荧光(Indirect immunofluorescence assay，IFA)和生长曲线试验结果显示，poly(C)长度减少不影响病毒的拯救，拯救病毒与亲本病毒具有相似的生长特性。动物感染试验结果显示，rEMCV-C9的LD50是2×104 TCID50，为亲本病毒EMCV-HB10的213倍，以上结果证明poly(C)的长度对病毒在BHK-21细胞上的生物学特性没有显著影响，但是缩短poly(C)降低了病毒对小鼠的致病力。重组拯救病毒rEMCV-C9得到了部分致弱。
　　已有的研究表明，致弱的门戈病毒(Mengo virus)可以作为潜在的活病毒载体表达异源抗原。缩短poly(C)的EMCV感染性克隆平台的建立为研究新型基因工程疫苗提供了有力的工具。EMCV-HB10在BHK-21细胞上连续190次传代和蚀斑克隆(plaque clone assay)，我们成功获得了一株克隆毒株，命名为EMCV-P190-C25。全病毒基因组测序表明，相对于亲本病毒EMCV-HB10，EMCV-P190-C25的2A蛋白缺失了127个氨基酸，还有一些氨基酸发生突变。随后我们将该病毒的部分基因克隆到pEMCV-C9骨架中，构建了一个重组病毒载体，命名为pC9-P190-Δ2A。在VP1和Δ2A的序列之间依次插入了一个起始裂解点，一个Flag标签和一个多克隆位点，并命名为pC9-P190-Flag-MCS-Δ2A。该重组质粒经BamHⅠ线性化后，体外转录的RNA对BHK-21具有感染性，获得的病毒命名为rC9-P190-Flag-MCS-Δ2A。动物试验结果表明，rC9-P190-Flag-MCS-Δ2A不引起小鼠死亡且无任何临床症状。为检测该病毒表达外源蛋白的能力，我们在pC9-P190-Flag-MCS-Δ2A的多克隆位点插入720bp的eGFP基因并成功拯救出重组病毒，命名为rC9-P190-Flag-eGFP-Δ2A，该病毒在BHK-21细胞上连续传代，5代内仍然可以稳定表达eGFP外源蛋白，western blot检测表明，eGFP存在两种表达形式，一种为GFP单独表达，一种为eGFP-VP1融合表达。总结以上试验结果，我们成功构建了EMCV-HB10的全长感染性克隆平台，利用蚀斑克隆方法分离了一个2A蛋白缺失毒株，并在此基础上构建了一个无毒力的病毒载体，可以用于外源蛋白的表达和病毒感染的示踪。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 EMCV国内外流行情况

1．2 EMCV的分类

1．3 EMCV的分子特征

1．3．1 EMCV 5’非编码区和3’非编码区

1．3．2 EMCV编码蛋白及其功能

1．4 EMCV的致病性

1．4．1 宿主范围及传播途径

1．4．2 临床症状及病理变化

1．5 EMCV疫苗研究进展

1．5．1灭活疫苗和弱毒苗

1．5．2 基因工程疫苗

1．6 EMCV反向遗传学进展

1．7 本研究的目的意义

第二章 EMCV-HB10毒株生物学特性的初步研究

2．1 实验材料

2．1．1 病毒株及实验动物

2．1．2 主要试剂

2．1．3 引物及探针的设计与合成

2．2 实验方法

2．2．1 EMCV-HB10 TCID50及生长曲线的测定

2．2．2 蚀斑试验

2．2．3 EMCV-HB10株存活曲线及半数致死量(LD50)的测定

2．2．4 组织器官组织病理学检查

2．2．5 组织RNA的提取及组织器官病毒含量的测定

2．3 结果

2．3．1 EMCV-HB10的生长曲线和蚀斑

2．3．2 EMCV-HB10半数致死量(LD50)的测定

2．3．3 小鼠的的存活曲线

2．3．4 小鼠组织病理变化

2．3．5 组织器官病毒含量测定

2．4 讨论

第三章 EMCV-HB10 cDNA感染性克隆的构建及其致病性研究

3．1 实验材料

3．1．1 病毒株、实验动物、菌株和细胞株

3．1．2 主要试剂

3．1．3 引物的设计与合成

3．1．4 主要试剂的配制

3．1．5 主要仪器设备

3．2 实验方法

3．2．1 EMCV总RNA的提取

3．2．2 EMCV RNA反转录为cDNA

3．2．3 EMCV-HB10 cDNA感染性克隆重组质粒的构建

3．2．4 EMCV-HB10株感染性克隆的拯救

3．2．5 拯救病毒的鉴定

3．3 实验结果

3．3．1 EMCV-HB10全长感染性克隆cDNA质粒构建

3．3．2 EMCV病毒的拯救

3．3．3 拯救病毒rEMCV-C9的RT-PCR测序鉴定

3．3．4 拯救病毒rEMCV-C9间接免疫荧光(IFA)鉴定

3．3．5 拯救病毒rEMCV-C9的生长特性

3．3．6 拯救病毒rEMCV-C9的蚀斑

3．3．7 拯救病毒rEMCV-C9的半数致死量(LD50)

3．4 讨论

第四章 EMCV重组疫苗载体及表达eGFP嵌合病毒的构建

4．1 实验材料

4．1．1 病毒及实验动物

4．1．2 主要试剂和仪器设备

4．1．3 引物的设计与合成

4．2 实验方法

4．2．1 病毒RNA的提取

4．2．2 RNA反转录为cDNA

4．2．3 重组质粒pC9-P190-Flag-MCS-Δ2A和pC9-P190-Flag-eGFP-Δ2A的构建

4．2．4 拯救病毒的鉴定

4．3 实验结果

4．3．1 拯救病毒rC9-P190-Flag-MCS-Δ2A的鉴定

4．3．2 拯救病毒rC9-P190-Flag-eGFP-Δ2A的鉴定

4．4 讨论

第五章 全文结论

参考文献

致谢

作者简历