脂肪来源干细胞胞外囊泡调控转化生长因子β-Smad信号通路抑制瘢痕增生的分子机制研究

摘要

目的 探讨脂肪干细胞-细胞外囊泡(ASC-EVs)对肌成纤维细胞转分化过程中转化生长因子β(TGF-β)-Smad信号通路的调控作用.方法 脂肪干细胞来源于南昌大学第二附属医院整形美容科行吸脂术患者的抽吸脂肪.真皮成纤维细胞来源于同一科室包皮环切术患者自愿捐赠的皮肤组织.将脂肪抽吸物离心纯化后经酶消化提取脂肪来源于细胞(ASCs),扩增后行流式细胞术检测表面蛋白标记物.收集第3～5代ASCs上清液提取胞外囊泡(EVs),透射电镜观察微观形态,纳米颗粒跟踪分析仪NanoSight检测粒径分布,流式细胞术检测其膜表面标志性蛋白CD63、Alix和TSG101.用PKH67荧光标记的ASC-EVs与真皮成纤维细胞共培养后,共聚焦显微镜观察细胞对EVs的摄取情况.通过TGF-β1持续诱导真皮成纤维细胞5d,并添加50、100 μg/ml浓度的ASC-EVs,通过免疫荧光染色,RT-PCR和蛋白质印迹法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)以及Smad-2/3/4的表达.结果 流式细胞术结果提示,第3代ASCs表面标记物CD73、CD49d、CD90、CD105为阳性,CD34、CD45为阴性.透射电镜下ASC-EVs为圆形膜性囊泡,边缘清晰,由双层磷脂膜包裹.95％以上的ASC-EVs粒径为(30.0～ 261.0)nm,平均(166.0±86.1)nm.EVs高表达标志蛋白CD63、Alix和TSG101.共聚焦显微镜下可见携带绿色荧光的ASC-EVs被真皮成纤维细胞摄取并分布在胞浆内,部分ASC-EVs在细胞核周围分布.α-SMA免疫荧光染色后,经连续5d的TGF-β1诱导,共聚焦显微镜下见真皮成纤维细胞中α-SMA绿色荧光的表达显著提高,而采用50 μg/ml和100 μg/ml ASC-EVs作用的真皮成纤维细胞中,α-SMA的表达较未经ASC-EVs作用的真皮成纤维细胞显著降低,但不呈现浓度依赖;细胞α-SMA和Smad-2/3/4的mRNA转录水平较未经ASC-EVs作用的真皮成纤维细胞显著下降,α-SMA和Smad-2/3/4的蛋白表达也显著降低.此外,ASC-EVs可显著降低细胞分泌至上清液中的Ⅰ型胶原的含量,但对Ⅲ型胶原的分泌量无明显干预作用.结论 ASC-EVs抑制瘢痕增生的作用机制可能与抑制真皮成纤维细胞中TGF-β-Smad信号通路,干扰肌成纤维细胞转分化,减少I型胶原分泌密切相关.