GST-TAT-P53c融合蛋白的表达及对p53基因突变型肿瘤细胞的促凋亡作用

摘要

目的 研究P53蛋白C端(P53c)对p53基因突变型肿瘤细胞SW480的促凋亡作用.方法 用人类免疫缺陷病毒TAT蛋白的蛋白转导域(TAT)将P53c运载进入肿瘤细胞,用氧依赖性降解区域(ODD)控制P53c在组织中的稳定性.通过PCR方法制备TAT-ODD-p53c(TOPc), TAT-p53c(TPc)及p53c基因,与pGEX4T载体连接后在大肠杆菌中表达谷胱甘肽-S-转移酶(GST)-TAT-ODD-P53c(GST-TOPc), GST-TAT-P53c(GST-TPc)及GST-P53c等融合蛋白.免疫组化方法检测TAT蛋白运载融合蛋白穿过SW480细胞膜的作用,MTT法检测融合蛋白对SW480细胞活力的影响,流式细胞仪检测致SW480细胞凋亡作用.结果 成功构建pGEX系列表达载体,并在大肠杆菌中可溶性表达.Western 印迹结果表明,重组蛋白可以和GST单克隆抗体特异性结合.免疫组化显示GST-TPc, GST-TOPcm及GST-TOPc均能进入SW480细胞,GST-TPc能明显降低SW480细胞活性,导致SW480细胞凋亡.含ODD的融合蛋白在常氧环境中对肿瘤细胞有轻度促凋亡作用.结论 TAT可以介导其融合蛋白跨越细胞膜.GST-TPc可引起p53突变型肿瘤细胞凋亡.