构建pCool-GST-ICAD/CAD并在大肠杆菌中表达CAD核酸酶及活性研究

摘要

目的:构建pCool-GST-ICAD/CAD的表达载体,并在大肠杆菌BL21(DF3)中表达具有生物学活性的CAD核酸酶.方法:用PCR扩增CAD核酸酶基因,将扩增产物克隆入pCool-GST-ICAD载体中构建出pCool-GST-ICAD/CAD表达质粒.经酶切和电泳鉴定正确后,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,表达产物经亲和层析、离子交换层析及凝胶过滤等方法分离纯化,最后用SDS-PAGE和DNA降解实验进行鉴定.结果:构建了pCool-GST-ICAD/CAD原核表达质粒,重组载体转化后表达出毫克级水平的GST-ICAD/CAD蛋白复合体,经分离纯化后得到纯度很好的CAD/ICAD蛋白复合体,在SDS-PAGE电泳上呈现清晰的两条蛋白带,经DNA降解实验证明纯化所得的CAD蛋白具有非特异性降解DNA的核酸酶活性.结论:成功构建具有生物学活性的CAD核酸酶,有助于进一步研究细胞凋亡的作用机制.