异丹叶大黄素下调膀胱癌细胞中细胞周期蛋白D1表达的分子机制研究

摘要

目的:探索异丹叶大黄素(ISO)下调肿瘤细胞中细胞周期蛋白D1表达的分子机制.方法:以ISO作用于人源性膀胱癌UMUC3、RT12和RT4细胞后用Western blotting法检测细胞周期蛋白D1表达水平;以RTPCR法检测细胞周期蛋白D1 mRNA的表达水平.稳定转染细胞周期蛋白D1启动子萤光素酶报告基因至UMUC3细胞并筛选后,检测ISO预处理后萤光素酶活性.ISO预处理UMUC3细胞后,提取核蛋白检测核转录因子表达水平的变化.分别稳定转染GFP和GFP-细胞周期蛋白D1表达构建载体,筛选克隆;ISO预处理后,Western blotting 法检测细胞周期蛋白D1的蛋白表达水平,贴壁依赖性细胞生长实验法检测细胞生长能力的变化,流式细胞术检测细胞周期的变化.分别稳定转染人源性细胞周期蛋白D1野生型和-163位点突变型萤光素酶报告基因质粒载体至UMUC3细胞并筛选,ISO预处理后检测细胞的萤光素酶活性.最后利用染色质免疫沉淀的方法,以抗Sp1抗体检测ISO对Sp1与细胞周期蛋白D1启动子结合力的影响.结果:ISO可从mRNA和蛋白水平显著抑制肿瘤细胞的细胞周期蛋白D1水平,并且是从内源性转录水平来抑制细胞周期蛋白D1的转录.ISO可抑制、下调核转录因子Sp1的表达,并抑制Sp1与细胞周期蛋白D1启动子区域的结合力,该结合位点主要位于启动子-92到+27bp的5’-非翻译区.结论:ISO可通过下调Sp1核转录因子表达及其与细胞周期蛋白D1启动子的结合,从内源性转录水平来抑制细胞周期蛋白D1的表达,从而诱导G0/G1细胞周期阻滞并抑制肿瘤细胞增殖.我们的研究将为临床中药单体ISO综合治疗肿瘤提供新的策略.