鞘糖脂微结构域1相关磷酸化蛋白基因影响高转移人前列腺癌细胞体外生物学行为的机制探讨

摘要

目的探讨鞘糖脂微结构域1相关磷酸化蛋白（PAG1）基因对高转移人前列腺癌细胞系PC-3M-1E8细胞体外生物学行为影响的机制。方法异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导JM109细菌中GST-Raft-Ras结合域（GST-Raft-RBD）融合蛋白的表达,其中Raft-RBD能特异性的与活性Ras（GTP-Ras）结合,聚丙烯酰胺凝胶电泳和考马斯亮蓝染色观察融合蛋白诱导表达结果。GST-pulldown实验检测稳定转染PAG1基因、转染空载体及未转染的PC-3M-1E8细胞中活性Ras水平。Western blot检测Ras信号通路相关蛋白表达变化。用异硫氰酸四甲基罗丹明（TRITC）耦联的鬼笔环肽标记F-肌动蛋白,激光扫描共聚焦显微镜观察肿瘤细胞形态和细胞内F-肌动蛋白排列变化。收集人前列腺及前列腺腺癌组织标本,通过免疫组织化学PV9000法检测PAG1蛋白的表达。结果 GST-Raft-RBD融合蛋白诱导表达结果显示,经IPTG诱导后在相对分子质量约33 000处出现较亮的GST-Raft-RBD融合蛋白条带。GST-pull down结果显示PC-3M-1E8细胞稳定转染PAG1基因后,活性Ras蛋白表达明显减少,总Ras蛋白表达无明显变化。Western blot检测结果显示PC-3M-1E8细胞稳定转染PAG1基因后,磷酸化胞外信号调节激酶（ERK）表达明显减少,总ERK表达无明显变化;细胞周期素D1（cyclin D1）表达明显减少;p21WAF1/CIP1蛋白及磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）表达无明显变化。TRITC耦联的鬼笔环肽标记F-肌动蛋白结果显示稳定转染PAG1基因的PC-3M-1E8细胞F-肌动蛋白骨架结构紊乱,丝网状结构不明显,细胞呈长梭形,细胞表面伪足明显较少。免疫组织化学检测结果显示正常前列腺组织PAG1蛋白表达阳性率较高,前列腺腺癌组织中随着Gleason分级的增加,PAG1蛋白表达阳性率降低。结论 PC-3M-1E8细胞中PAG1表达上调能降低Ras活性,抑制ERK活化,进一步抑制cyclin D1的表达而引起细胞周期阻滞,抑制细胞增殖。PAG1表达上调可引起PC-3M-1E8细胞运动、侵袭和转移能力降低。正常前列腺组织中PAG1蛋白表达阳性率较高,前列腺腺癌组织中PAG1蛋白的表达与肿瘤细胞的分化程度及恶性程度相关。