应用cDNA RDA联合cDNA阵列点杂交筛查差异表达基因的方法学分析

摘要

目的探讨采用cDNA代表性差异分析法(representational difference analysis,RDA)联合cDNA阵列点杂交筛查差异表达基因的可行性及局限性.方法将17β雌二醇(E2)干预MG-63细胞cDNA分别制备成检测和驱赶扩增子进行消减杂交作为整个cDNA RDA的内部质控,以干预组扩增子、对照组扩增子和第4轮双向消减产物为模板,行内对照基因GAPDH的RT-PCR进行消减效率分析,Southern杂交证实消减产物来源,快速Northern杂交证实消减产物确实呈差异表达;克隆到pGEM-T easy载体,转化JMl09感受态细菌并铺Amp+/X-gal/IPTG琼脂皿得到差异表达文库,随机挑取白色单菌落培养后点成尼龙阵列膜,分别与干预组和对照组扩增子及第4轮消减产物杂交,得到差异表达克隆用于后续研究.结果内部质控结果显示,第3轮消减杂交后,PCR未见差异性产物扩增;cDNA RDA共得到3个雌二醇诱导表达上调条带和2个表达下调条带.Southern杂交结果显示在检测扩增子及第1～4轮差异产物中均可见阳性杂交信号,而驱赶扩增子中无杂交信号;快速Northern杂交证实干预组细胞总RNA的两处杂交信号均较对照组强;阵列膜同一克隆两个点对应的杂交信号呈高度相关一致性,共得到120个差异表达克隆(56个表达上调,64个表达下调).结论cDNA代表性差异分析法联合cDNA阵列点杂交方法能有效快速高通量筛查E2诱导MG-63差异表达基因.