骨巨细胞瘤GCF-5抗原的cDNA克隆化及其在大肠杆菌中的表达

摘要

目的 ＧＣＦ－５是骨巨细胞瘤（ＧＣＴ）特异性单抗，其抗原是了解ＧＣＴ特性的途径之一。为了利用这一途径，对ＧＣＦ－５抗原的ｃＤＮＡ进行了克隆及表达。方法 盐酸胍和有机溶剂法提取总ＲＮＡ，Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）－Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ亲和层析法分离ｍＲＮＡ，反转录合成ｃＤＮＡ，用 ｇｔ１１Ｓｆｉ－Ｎｏｔ表达载体构建ｃＤＮＡ文库，免疫学筛选并克隆ＧＣＦ－５抗原的ｃＤＮＡ，大肠杆菌Ｙ１０８９表达含ＧＣＦ－５抗原的融合蛋白，细胞免疫抑制实验证实该融合蛋白含有ＧＣＦ－５抗原成分。结果 经Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）－Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ亲和层析法分离的ｍＲＮＡ，浓度达２０．５６μｇ／ｍｌ，ＯＤ２６０／２８０比值为１．８６９，经反转录所得的ｃＤＮＡ产物从数百到数千ｂｐ之间，产物完整；构建的 ｇｔ１１Ｓｆｉ－Ｎｏｔ载体经体外包装后均呈无色透明噬斑，用抗体筛选出了一阳性噬斑，重复克隆化所得噬斑均可被抗体染色；该噬菌体感染大肠杆菌Ｙ１０８９，分别于３２℃与４２℃培养，选出溶源菌，ＩＰＴＧ诱导融合蛋白，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ显示稍大于正常β－半乳糖苷酶的融合蛋白带，与融合蛋白预孵育后的抗体所做细胞免疫化学染色不显色。结论 构建了完整的ＧＣＴｃＤＮＡ文库；?