永生化人晶状体上皮细胞细胞周期调控相关基因表达的检测

摘要

目的探讨人类晶状体上皮细胞(human lens epithelial cells, HLEC)周期调控中的细胞周期蛋白E、细胞周期蛋白激酶(cyclin dependent kinase 2, CDK2)和细胞周期蛋白激酶抑制因子(cyclin-dependent-kinase inhibitor, CKI)p21基因的表达,阐明HLEC增殖和晶状体后囊膜混浊(posterior capsule opacification, PCO)的分子机制.方法体外培养永生化HLEC系HLE-B3,用二步过量胸苷阻断法进行细胞周期同步化;流式细胞仪检测细胞周期;收集不同时相的细胞提取总RNA.用逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)方法检测细胞周期蛋白E、CDK2和p21的mRNA表达;分别用免疫组织化学染色和Western blot法检测细胞周期蛋白E和CDK2及p21的蛋白表达.结果流式细胞仪检测:HLE-B3细胞周期处于G1期,占33.5 %;S期,占46.1%;G2期,占20.4%;处于S期及G2期细胞的比例约占总数的66.5%.RT-PCR检测:可见不同周期时相的HLE-B3细胞(细胞周期蛋白E和CDK2)mRNA的表达,但在不同步化的细胞时相中未检测出细胞周期蛋白E的表达.而在同步化的S期细胞中有少许p21 mRNA表达.免疫组织化学染色未检测出细胞周期蛋白E阳性细胞,仅可检测出少部分p21阳性细胞.Western blot法检测结果:CDK2阳性表达以S期细胞明显,G1期和G2期略低于S期表达.不同步化细胞也有CDK2的表达.提示细胞周期蛋白E、CDK2 与p21的mRNA蛋白表达不平衡.结论体外培养HLE-B3细胞周期过程中存在细胞周期蛋白E、CDK2 和p21的表达,且存在表达不平衡.细胞周期蛋白E、CDK和CKI间的表达不平衡有可能是其体外增殖细胞周期分子机制之一.