1,3-O,N螺杂环类乙酰肝素酶抑制剂对子宫颈癌HeLa细胞生长的抑制作用

摘要

Objective To provide the theoretical supportting for targeted heparanase (HPA) inhibition of cervical cancer through observing the anti-proliferative effect of the HPA inhibitor on HeLa cell line of cervical cancer. Methods The two series of 13 kinds of novel HPA inhibitors were synthesized and optimized. Heparan degrading enzyme assay kit was used to test the effect of the inhibitors on the inhibition of HPA enzyme activity. Methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) method and scratch test were used to observe the anti-proliferative and the migration effect of the inhibitors on HeLa cells. Flow cytometry was performed to determine the cell cycles and apoptosis. The expression of HPA was evaluated by reverse transcription (RT)-PCR, western blot and immunocytochemistry. Results All tested inhibitors could inhibit the activity of HPA enzyme [the range of 50% inhibiting concentration (IC50) values from 4.47 to 47.19 μmol/L] and the growth of HeLa cells (the range of IC50 values from 48.16 to 96.64μmol/L). Among them, No.16 compound exhibits the strongest inhibition against the growth of HeLa, which could arrest the cell into G0/G1 and G2/M phases. The rate of cell apoptosis in the group treated with 50μmol/L No.16 for 48 hours [(11.9±1.2)%] was significantly higher than that [(6.6 ± 1.8)%] in untreated group (P=0.013). Real time PCR and western blot showed that expression levels of HPA mRNA (1.23±0.46) and protein (0.46±0.31) significantly decreased in the treated group as compared with the levels of HPA mRNA (3.43 ± 0.45) and protein (1.30 ± 0.58) in the untreated group (both P<0.05). Immunocytochemistry also showed that the treatment of No.16 significantly reduced the average optical density (0.39 ± 0.04) of HPA immuostaining signal compared with that in the control group (0.50 ± 0.09; P=0.026). Conclusion Novel 1,3-O,N spiroheterocyclic HPA inhibitors could inhibit the proliferation of HeLa cells,inhibit the HPA enzyme activity in different degree, and down-regulate the expression of HPA protein.%目的：通过观察乙酰肝素酶（HPA）抑制剂对子宫颈癌HeLa细胞体外生长的抑制作用及HPA表达的影响，为子宫颈癌HPA分子靶向治疗提供理论依据。方法优化设计并合成了两个系列共13种1，3-O，N螺杂环类化合物，产品编号为10～22号，其中21号为HPA抑制剂——DMBO化合物，余12种为新合成的化合物。其中，1个系列含甲氧苯基，产品编号为10～14号；另1个系列不含甲氧苯基，产品编号为15～22号。（1）采用乙酰肝素降解检测试剂盒检测新合成的化合物（选择与DMBO结构类似度高的6个化合物，即14、15、16、20、21、22号化合物）对HPA活性的作用，以50%抑制浓度（IC50）表示作用的强弱；（2）四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测新合成的化合物（7个化合物，即11、12、14、15、16、20、22号化合物）作用后HeLa细胞生长的抑制作用，选择抑制作用最大的化合物（即16号化合物）用于以下实验；（3）细胞划痕实验观察16号化合物作用后HeLa细胞迁移能力的变化；（4）流式细胞仪检测16号化合物作用后HeLa细胞的细胞周期比例和细胞凋亡率的变化；（5）实时定量逆转录（RT）-PCR技术、蛋白印迹法和免疫组化法检测16号化合物作用后HeLa细胞中HPA mRNA和蛋白表达的变化。结果（1）6个新合成的化合物（即14、15、16、20、21、22号化合物）对HPA活性均有不同程度的抑制作用，除22号化合物抑制作用不明显无法测出IC50值外，14、15、16、20、21号化合物的IC50值分别为4.47、21.81、8.36、14.13、47.19μmol/L。（2）MTT比色法检测显示，不同浓度（分别为1、5、15、30、60、120、180、240μmol/L）的7个新合成的化合物（即11、12、14、15、16、20、22号化合物）作用48 h对HeLa细胞的生长均有抑制作用，并呈明显的浓度依赖性（P<0.01），其中16号化合物的抑制效果最显著（IC50值为48.16μmol/L）；进一步检测显示，16号化合物作用不同时间（分别为24、48、72、96 h）后对HeLa细胞生长的抑制作用呈明显的时间依赖性（P<0.01）。（3）细胞划痕实验观察显示，作用24 h后，实验组（加入50μmol/L的16号化合物，下同）HeLa细胞迁移能力明显受到抑制，其划痕的宽度明显大于对照组（不加16号化合物，下同）。（4）流式细胞仪检测显示，作用48 h后，实验组HeLa细胞G0/G1期、G2/M期比例分别为（75.85±1.77）%、（11.65±0.64）%，均明显高于对照组[分别为（49.10±3.11）%、（0.17±0.24）%；P<0.01]；S期细胞比例为（12.50±1.13）%，明显低于对照组的（50.70±2.83）%（P=0.003）。实验组HeLa细胞的凋亡率为（11.9±1.2）%，明显高于对照组的（6.6±1.8）%（P=0.013）。（5）实时定量RT-PCR技术和蛋白印迹法检测显示，作用48 h后，实验组HeLa细胞中HPA mRNA和蛋白的表达水平分别为1.23±0.46和0.46±0.31，明显低于对照组的3.43±0.45和1.30±0.58（P<0.05）；免疫组化法检测显示，实验组累积吸光度（IA）值为0.39±0.04，对照组为0.50±0.09，两组比较，差异有统计学意义（P=0.026）。结论新型1，3-O，N螺杂环类HPA抑制剂可能通过凋亡途径显著抑制子宫颈癌HeLa细胞的生长；该类抑制剂可明显抑制HeLa细胞的HPA活性，并下调其HPA mRNA和蛋白的表达。