MiR-9a-5p靶向SPTLC2抑制神经元创伤后凋亡的作用及其机制研究

摘要

目的初步探讨微小RNA-9a-5p（miR-9a-5p）靶向丝氨酸棕榈酰转移酶长链碱性亚基2（SPTLC2）抑制大鼠原代神经元创伤后凋亡的作用及其机制。方法体外培养大鼠原代神经元, 将其分为对照组（n=9）、无意义序列转染组（n=9）和miR-9a-5p模拟物转染组（n=9）, 并分别建立机械划伤模型。通过转染、实时荧光定量PCR、Western blot和TUNEL荧光染色等方法观察miR-9a-5p对大鼠原代神经元凋亡的影响。利用生物信息学预测、荧光素酶基因报告实验和挽救实验验证SPTLC2与miR-9a-5p的关系。利用蛋白质相互作用数据库预测、免疫共沉淀实验验证SPTLC2相互作用的蛋白。结果实时荧光定量PCR结果显示, miR-9a-5p模拟物转染组miR-9a-5p的相对表达量（6.162±0.184）较对照组（0.938±0.058）和无意义序列转染组（1.010±0.095）明显增高（均P＆0.05）。Western blot实验结果显示, miR-9a-5p模拟物转染组SPTLC2的相对表达量（0.272±0.034）较对照组（0.855±0.037）和无意义序列转染组（0.880±0.040）明显降低（均P＆0.05）;凋亡相关蛋白检测结果表明, miR-9a-5p模拟物转染组神经元的凋亡程度较对照组和无意义序列转染组显著降低（均P＆0.05）。TUNEL染色结果显示, 高表达miR-9a-5p可抑制神经元凋亡, miR-9a-5p模拟物转染组的凋亡细胞比例（0.165±0.004）较对照组（0.239±0.008）和无意义序列转染组（0.229±0.010）显著降低（均P＆0.05）。荧光素酶基因报告实验和挽救实验证实, SPTLC2是miR-9a-5p的直接靶点。免疫共沉淀实验和Western blot结果表明, SPTLC2可与Toll样受体4（TLR4）、核因子NF-κB p105亚基（NF-κB1）分别相互作用, 但不影响二者的表达水平（均P＆0.05）。miR-9a-5p可影响TLR4的表达水平（P＆0.05）, 但不影响NF-κB1的表达水平（P＆0.05）。结论 SPTLC2是miR-9a-5p抑制神经元凋亡的一个新靶基因。MiR-9a-5p可降低细胞损伤后SPTLC2的表达水平, 并通过TLR4/NF-κB信号通路抑制神经元凋亡。