载体质粒介导的TGF-β1短发夹RNA及TGF-β1反义RNA对人腹膜纤维化的影响

摘要

目的研究pcDU6载体质粒介导的转化生长因子β1(TGF-β1)短发夹RNA(shRNA)对体外培养的人腹膜间皮细胞(HPMC)TGF-β1表达的影响,并与TGF-β1反义RNA对HPMC的作用比较.方法针对TGF-β1的以ggcc开始的21碱基大小的片段,分别设计2对寡核苷酸,形成双链后将其依次连入带有U6启动子的pcDNA3.1(-)载体(命名为pcDU6).2.对DNA双链通过BamHI酶切位点连接后形成中间由6碱基序列间隔的反向互补序列,构建成TGF-β1短发夹RNA的产生质粒.并构建反义TGF-β1基因真核表达载体.采用胰蛋白酶消化法从人大网膜组织中分离间皮细胞,建立稳定的体外培养模型.用脂质体转染表达TGF-β1 shRNA的pcDU6载体质粒和表达反义TGF-β1RNA的pcDNA3.1(-)的载体质粒导入高糖(4.25%D-葡萄糖)和细菌脂多糖(LPS)刺激下人腹膜间皮细胞.采用逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)半定量分析HPMC中TGF-β1 mRNA的表达以及纤连蛋白(FN)、Ⅰ型纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)和胶原Ⅰ(Col Ⅰ)的mRNA表达.采用双抗夹心法酶联免疫吸附实验检测HPMC培养液中TGF-β1蛋白质水平以及FN和PAI-1的蛋白质水平.结果HPMC在高糖和LPS的刺激下可明显上调TGF-β1的表达(P＜0.01).TGF-β1反义RNA转染HPMC 24 h后,与对照组相比,FN、Col Ⅰ、PAI-1 mRNA分别下调17%、26%、9.6%;转染48 h后FN、PAI-1蛋白含量亦明显下降(P＜0.05).pcDU6载体质粒介导的TGF-β1 shRNA干扰组较GS+LPS组及pcDU6空载体组明显下调TGF-β1的表达(P＜0.01);pcDU6载体质粒介导的TGF-β1 shRNA干扰组间比较并无明显差别(P＞0.05);pcDNA3.1(-)的载体质粒介导的反义RNA组与pcDU6空载体组比较并无明显差别(P＞0.05);pcDU6载体质粒介导的TGF-β1 shRNA干扰组较pcDNA3.1(-)的载体质粒介导的反义RNA组明显下调TGF-β1的表达(P＜0.01).结论pcDU6载体质粒介导的TGF-β1shRNA能够明显抑制高糖和LPS刺激下的HPMC TGF-β1的基因表达,可能是防治CAPD患者腹膜纤维化的一种有效方法.