限制性内切酶结合竞争聚合酶链反应定量检测在多药耐药基因甲基化状态中的应用

摘要

目的建立定量检测多药耐药基因(MDR1)甲基化状态的方法.方法在MDR1基因启动子区含甲基化位点的-102～+186 bp片段间设计1条正义引物和2条反义引物,采用不同的反义引物,经3次聚合酶链反应(PCR)获得较目的片段缺失30 bp的竞争内标DNA片段,以Pbluescriptsk+为载体构建竞争内标DNA质粒;待检基因组DNA经甲基化敏感的限制性内切酶HpaⅡ消化后与竞争内标DNA竞争扩增MDR1基因; PCR产物经琼脂糖凝胶电泳和凝胶成像分析仪扫描,目的片段量等于反应体系中竞争内标量乘以目的片段与竞争内标片段的光密度比值, HpaⅡ酶切与未经酶切标本所得目的片段量的比值为甲基化率.结果倍比稀释的基因组DNA与最佳量竞争内标共扩增MDR1基因启动子区目的片段,两扩增产物量的比值与基因组DNA量呈显著正相关,相关系数r=0.992,P<0.001.结论本方法用于MDR1 基因甲基化定量检测,操作相对简单,定量准确可靠,适用于临床研究中大量样本检测.