Ⅱ型胶原C端肽单克隆抗体制备及鉴定

摘要

目的制备Ⅱ型胶原 C 端肽中 EKGPDP多肽片段（谷氨酸-赖氨酸-甘氨酸-脯氨酸-天冬氨酸-脯氨酸）的单克隆抗体（McAb）,并进行抗体的纯化、鉴定及初步临床验证。方法采用戊二醛法制备 EKGPDP-钥孔嘁血蓝素（key hole limpet hemocyanin,KLH）抗原载体复合物。腹腔及静脉攻击法免疫 BALB/c 小鼠8只。按常规方法将小鼠骨髓瘤细胞和免疫小鼠脾细胞融合。筛选阳性克隆株,以有限稀释法克隆3次。对杂交瘤细胞株的染色体、亲和力、类型和稳定性进行鉴定,取其中亲和力较高的6株制备腹腔积液,用盐析及蛋白 G 琼脂糖凝胶珠层析法纯化抗体。对 McAb 的纯度、特异性、交叉反应性及免疫活性进行鉴定。用免疫组化法对骨性关节炎膝关节软骨和椎间盘软骨样品进行分析。结果本研究获得13株能高效分泌特异性 McAb 的杂交瘤细胞株;经5个月传代35代和反复冻存复苏6次,培养上清稳定性良好。6株 McAb 腹腔积液效价分别为2.8×10~4（EKG7）、5.1×10~5（EKG14）、5.1×10~5（EKG16）、5.1×10~5（EKG18）、5.1×10~5（EKG25）、3.2×10~4（EKG28）。电泳结果证明,盐析法纯化腹腔积液得到的单克隆抗体回收量、活性、存放1周后活性分别为8.07 mg、3.35(A450)、3.10(A450),蛋白 G 亲和层析法得到的单克隆抗体回收量、活性、存放1周后活性分别为0.32mg、1.83(A450)、0.66(A450),盐析法优于蛋白 G 亲和层析法（t=25.26,P＜0.01）。抗体的最佳应用浓度为（50～150）μg/L。临床初步鉴定发现,6株 EKGPDP 单克隆抗体在骨性关节炎及突出椎间盘软骨标本中出现了不同程度的阳性结果。结论本研究成功获得抗Ⅱ型胶原 C 端肽片段 McAb,为Ⅱ型胶原降解产物的测定提供了研究工具。