慢性HBV感染者肝组织HBV cccDNA的定量检测

摘要

目的 建立一种肝活检组织中HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)的定量检测方法.方法 待检肝组织标本共21份,来源于江苏省人民医院肝脏手术患者,包括19份慢性HBV感染,其中HBeAg(+)标本10份,HBeAg(-)标本9份,4份非HBV感染为阴性对照组,取HBV DNA阳性的患者外周血作为rcDNA组.检测方法的主要步骤为肝组织经蛋白酶K和细胞裂解缓冲液消化后,用液相抽提法提取核酸,将提取的核酸溶液分为2等份.1份用特异性降解单链DNA的核酸酶加以消化,纯化后使用跨缺口引物和SYBR Green Ⅰ荧光染料进行实时荧光定量PCR分析;另1等份则用以定量检测肝细胞看家基因(β-Globin)作为样本细胞参数.检测结果的特异性主要通过PCR反应产物的序列分析及rcDNA组结果的对照进行证实,HBeAg(+)组和HBeAg(-)组cccDNA水平的差异通过两样本t检验进行分析.结果 PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析显示扩增产物的碱基数为350 bp左右,DNA测序分析提示产物与目的 片段的序列符合率为99%以上,且以rcDNA为对照的结果均为阴性,排除最有可能造成假阳性的rcDNA对结果的干扰.本方法对10 mg HBeAg(+)肝组织标本的cccDNA的检测阳性率为100%.血清HBeAg(+)的肝组织样本的平均HBV cccDNA水平高于HBeAb(+)的肝组织标本(P＜0.05).结论 通过上述三种途径证实了本文所建立方法的特异性.应用SYBR Green Ⅰ荧光染料和β-Globin作为样本细胞参数所建立的实时荧光定量PCR方法检测肝细胞内HBV cccDNA,具有较高的特异性、敏感性,且成本较低的特点.