大鼠TGF-β1 mRNA表达水平的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法的建立

摘要

目的建立检测大鼠TGF-β1 mRNA表达水平的SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR方法.方法摸索SYBRGreen Ⅰ工作液的配制方法,筛选PCR反应液,优化反应中引物和MgCl2的浓度,以actin为对照,建立大鼠TGF-β1 mR-NA表达水平的SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR方法并检测大鼠肾皮质TGF-β1 mRNA表达水平.结果SYBR GreenⅠ工作液,40倍水溶液稳定性好,最佳反应稀释度为1:10000.大鼠TGF-β1表达水平的SYBR Green荧光定量PCR方法,TGF-β1和actin的最佳MgCl2反应浓度分别为2.5 mM和3.5 mM,引物浓度分别为0.8 μM和0.5 μM,特异扩增产物的熔解温度分别为88.1和88.6℃,因此选择在85℃时收集荧光信号.正常大鼠TGF-β1的Ct值在29.03,actin的Ct值在24.86,扩增效率分别为0.995和1.08.结论通过优化反应条件和特异性分析,成功地建立了特异、敏感的大鼠TGF-β1 mRNA SYBRGreen Ⅰ荧光定量RT-PCR.SYBRGreen Ⅰ荧光定量PCR快速、敏感、特异、经济,可以满足临床和科研的需要.