大鼠TIMP1 miRNA慢病毒RNAi载体的构建及其对HSC-T6细胞TIMP1表达影响的研究

摘要

目的 构建大鼠TIMP1 miRNA慢病毒RNAi载体,并观察其转染HSC-T6细胞后对TIMP1基因表达的影响.方法 根据BLOCK-It Poll miR RNAi Expression System with EmGFP要求,应用在线miRNA设计工具http://rnaidesigner.invitrogen.com/maiexpress/,针对大鼠TINP1基因(GenBank:U06179)的598位点设计、合成Oligo DNA,退火形成双链DNA后,与载体pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR连接,转化Top10感受态细胞,构建TIMP1 miRNA慢病毒RNAi载体.经PCR扩增及测序鉴定正确后,以脂质体Lipofectimine.TM2000介导转染经TGF-β1刺激的大鼠肝星状细胞株HSC-T6,24、48、72h后收集细胞,应用RT-PCR鉴定TIMP1的表达情况.结果 经PCR及测序鉴定构建的TIMP1 miRNA慢病毒RNAj载体正确;将其转染经TGF-β1刺激的大鼠肝星状细胞株HSC-T6,48 h即可见TIMP1 Mrna表达量下降,72 h检测不到TIMP1 Mrna的表达,而未转染组及转染pLacZ-miR/GFP(阴性对照)组未见此改变.结论 成功构建大鼠TIMP1 miR-NA慢病毒RNAi载体Ptimp1-miR/GFP;Ptimp1-miR/GFP使大鼠肝星状细胞株HSC-T6 TIMP1基因沉默.提示了RNA干扰可使肝纤维化形成过程中的关键因子TIMP1基因沉默,为RNA干扰技术进一步应用治疗大鼠肝纤维化模型奠定了基础.