携带Hsp47特异性siRNA的人源单链抗体融合蛋白诱导人原代肝星状细胞凋亡研究

摘要

目的构建携带Hsp47特异性siRNA的人源单链抗体融合蛋白,并探讨其诱导肝星状细胞凋亡的作用。方法通过噬菌体展示技术得到单链抗体,采用分子克隆的方法将单链抗体ScFv和鱼精蛋白截短体tp基因融合,经转化,筛选,酶切连接测序后诱导表达并纯化蛋白,间接免疫荧光检测人原代肝星状细胞,人正常肝细胞7701对ScFv/tP融合蛋白的内吞效率;凝胶迁移阻滞实验检测ScFv/tP融合蛋白与DNA结合活性;Hsp47靶向性siRNA转染人原代肝星状细胞后,利用RT-PCR和Western blot分别检测细胞内Hsp47 mRNA和蛋白的表达情况;ScFv/tP融合蛋白介导Hsp47-siRNA转染肝星状细胞后,采用流式细胞仪和Westernblot分析其对细胞凋亡的影响,用CCK-8法分析其对细胞增殖的影响。两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析。结果所获得的ScFv/tP融合蛋白能够被人原代肝星状细胞内化进入细胞内,而不能被人正常肝细胞所内化,由ScFv/tP融合蛋白介导的Hsp47-siRNA能够降低人原代肝星状细胞Hsp47 mRNA及蛋白的表达水平,且转染后能够诱导肝星状细胞凋亡的发生。结论人源单链抗体融合蛋白是一种良好的载体,能够转移靶向Hsp47特异性siRNA的诱导人原代肝星状细胞凋亡。