丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活基因11的克隆化研究

摘要

目的为了探索丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)病毒蛋白反式激活作用的新的靶基因,我们应用基因芯片技术对于转染和未转染的肝母细胞瘤细胞系HepG2进行分析.研究结果将有助于阐明HCV感染相关疾病的发病机制.方法根据HCV-H病毒株序列设计、合成序列特异性的引物.以含有全长HCV-H株cDNA的pBRTN-3011质粒DNA作为模板,进行多聚酶链反应(PCR)扩增,获得的HCV NS5A编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定,构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5A.以pcDNA3.1(-)-NS5A转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取总RNA,逆转录为cDNA后进行表达谱基因芯片分析.应用分子生物学技术,结合生物信息学技术(bioinformatics),克隆HCV NS5A反式激活作用的新的靶基因.结果构建了真核表达载体pcD-NA3.1(-)-NS5A,经过限制性内切酶作图分析和核苷酸序列分析证实正确无误.以PCDNA3.1(-)-NS5A转染HepG2后提取总RNA,逆转录后进行表达谱基因芯片技术分析.应用分子克隆技术结合生物信息学技术克隆NS5A反式激活的新型靶基因,命名为NS5ATP11,新基因的编码基因序列全长为1257个核苷酸(nt),编码产物由418个氨基酸残基(aa).结论HCV NS5A是一种典型的病毒基因组编码的具有反式激活作用的蛋白.基因芯片技术是分析基因表达谱变化的有效和高通量技术.发现了HCV NS5A反式激活作用的新的靶基因,这一发现,为阐明HCV NS5A蛋白的反式激活作用及其机制,开辟了新的研究方向.