三种大鼠肝细胞分离及原代培养方法的比较

摘要

目的 比较3种大鼠肝细胞原代分离培养方法的差异.方法 采用原位两步胶原酶灌流法(A法)、离体两步灌流法(B法)及剪切消化法(C法)3种方法分离大鼠肝细胞,采用血细胞计数法计数肝细胞产量,采用0.4％锥虫蓝染色观察细胞活力,Percoll分离液密度梯度离心法纯化肝细胞至活力在92％以上,然后接种于杜尔伯科改良伊格尔培养基(DMEM)-F12培养基中培养,糖原染色(PAS)法鉴定肝细胞,倒置相差显微镜观察肝细胞形态,定期收集肝细胞培养液上清检测葡萄糖、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)及白蛋白的水平.结果 A、B、C法分离获得的肝细胞总数分别为(2.14±0.66)×108、(2.09±0.58) ×108、(1.16±0.03) ×108个/整肝,C法与A法对比差异有统计学意义(P＜0.01);A、B、C法获得的大鼠肝细胞活力分别为(93.80±4.68)％、(84.40±2.43)％、(38.95±4.89)％,B法与A法对比差异有统计学意义(P＜0.05),C法与A法对比差异有统计学意义(P＜0.01);培养液上清葡萄糖水平在3～11d维持在一个稳定水平;AST、ALT水平在培养3d后下降显著,6～9 d后维持在相对稳定的水平.白蛋白的分泌功能第7天达高峰,11d内维持在较稳定水平.培养液上清第7天上述生化指标,B法和C法与A法对比差异无统计学意义(P＞0.05).结论 A、B、C3种分离方法均成功分离并原代培养了肝细胞,C法获得的肝细胞产量和活力较低.DMEM-F12培养条件下肝细胞可有效保持良好形态结构和一定的生物合成代谢能力,实验显示第5 ～11天为肝细胞体外功能研究的最佳阶段.