新型机械敏感性离子通道在软骨细胞凋亡中的作用机制

摘要

目的观察新型机械敏感性离子通道压电蛋白1（Piezol）在骨性关节炎患者软骨细胞中的表达并探讨其在软骨细胞凋亡中的作用机制。方法体外培养骨性关节炎患者退变软骨细胞,利用细胞体外加力实验系统（FX-5000 Tension System）处理细胞,根据预实验结果分成0 h加力组（空白组）、2 h加力组、12 h加力组、24 h加力组、48 h加力组和相应的抑制剂红玫瑰毛蜘蛛来源刮刀样机械敏感毒剂4型（GsMTx4）组、抑制剂氟甲基酮（Z-ATAD-FMK）组。利用反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测不同力学条件刺激下各组细胞的Piezo1、半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶-12（Caspase-12）、蛋白激酶R样内质网激酶（PERK）、葡萄糖调节蛋白78（GRP78）、激活因子4（ATF4）和C/EBP环磷酸腺苷反应元件结合转录因子同源蛋白（CHOP）的表达量。钙离子荧光探针（Fluo3-AM）试剂盒检测空白组,加力组和抑制剂组细胞胞质内的钙离子含量。膜联蛋白V-碘化丙锭（AnnexinV-PI）凋亡试剂盒检测各分组的凋亡。结果 （1）Pizeol mRNA在骨性关节炎退变软骨中有少量表达,且12 h加力组表达量增加,为51.21±7.42(采用2-ΔΔGt的方法无计量单位),24 h加力组达到高峰,为153.98±10.34,48 h加力组为73.98±14.01,与24 h加力组比较,Piezol mRNA的表达出现下降（P=0.013）。内质网应激信号分子Caspase-12、PERK、GRP78、ATF4和CHOP的mRNA的表达也出现相同趋势。（2）2 h加力组软骨细胞胞质中的钙离子较空白组有所增加,钙离子荧光强度由（226±25）nm增加到（481±19）nm,P=0.032,12 h加力组钙离子浓度升高,荧光强度为（612±21）nm,24 h加力组钙离子浓度达峰值,荧光强度为（1 009±29）nm,48 h加力组钙离子荧光强度为[（609±91）nm],48 h加力组钙离子浓度较24 h加力组有所降低（P=0.017）。（3）在牵张应力作用下,2h加力组早期细胞凋亡率为（0.214±0.091）%,较空白组开始增加（P=0.044）,12 h加力组晚期凋亡率为（0.258±0.115）%,较空白组开始增加（P=0.028）,24 h加力组的晚期细胞凋亡率达峰值,为（0.587±0.214）%,但48 h加力组凋亡率为（0.231±0.218）%,较24 h加力组有所降低（P=0.033）。结论机械敏感性离子通道Piezol参与骨性关节炎的软骨细胞晚期凋亡过程,并且是以钙离子为第二信使,通过内质网应激通路启动细胞的凋亡过程。