生长激素促泌素受体1a慢病毒载体的构建及其对直肠癌SW480细胞生长和凋亡的影响

摘要

目的建立靶向生长激素促泌素受体1a（GHSR1a）基因短发夹干扰RNA（shRNA）慢病毒表达载体,感染至人直肠癌细胞株SW480,观察沉默GHSR1a基因对体外SW480细胞生长和凋亡的影响。方法 Western blot检测GHSR1a在人直肠癌Caco-2和SW480细胞及人正常结肠上皮细胞株NCM460中的表达;构建特异性靶向GHSR1a基因的shRNA慢病毒表达载体和阴性对照序列慢病毒载体;通过慢病毒感染建立稳定表达GHSR1a shRNA的SW480细胞（KD）、阴性对照细胞（NC）及空白对照细胞（BC）,反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测GHSR1a mRNA在细胞中的表达;通过Western blot技术检测细胞中GHSR1 a蛋白的表达;细胞计数试剂盒（CCK-8）法测定感染GHSR1a shRNA后对SW480细胞增殖的影响;流式细胞术检测细胞凋亡。结果在体外实验中,GHSR1 a蛋白在Caco-2和SW480细胞中的表达水平分别为89.24±12.95和124.82±17.67,明显高出NCM460细胞中的表达水平（23.51±4.28）;通过荧光表达及流式细胞学结果表明成功建立稳定表达GHSR1a shRNA的SW480细胞;SW480细胞感染GHSR1a shRNA后,GHSR1a蛋白在BC、NC和KD组中的表达分别为73.27±8.69、69.82±7.14和11.73±1.94,GHSR1a mRNA在BC、NC和KD组中的相对表达量分别为124.31±14.78、136.62±17.20和38.94±4.13,KD组细胞中GHSR1a蛋白及mRNA的表达明显低于BC组或NC组（P=0.000）;沉默GHSR1a基因72 h后,KD组细胞增殖较BC组下降（32.24±3.67）%,差异有统计学意义（P=0.002）;感染GHSR1a shRNA 72 h后,BC、NC和KD组细胞早期凋亡率分别为（2.3±0.5）%、（3.4±0.6）%和（12.4±3.5）%,KD组细胞早期凋亡率明显高于BC组或NC组（P=0.000）。结论慢病毒介导的GHSR1a shRNA对体外人直肠癌细胞生长有明显抑制作用,并促进细胞凋亡,表明GHSR1a基因有可能具有影响直肠癌发生发展的作用。