重组质粒pRNAT-U6.1/CFB siRNA的构建、鉴定及其对人脐静脉内皮细胞增生的影响

摘要

背景 脉络膜新生血管（CNV）是多种眼部疾病致盲的原因之一,研究发现补体系统在CNV的发病机制中起重要作用.目的 构建针对补体因子B（CFB）的小干扰RNA（siRNA）重组质粒,体外观察其对人脐静脉内皮细胞ECV-304增生的影响.方法 根据人CFB的基因序列设计引物,经PCR扩增后与质粒pRNAT-U6.1连接,得到重组质粒pRNAT-U6.1/CFB siRNA,并进行测序鉴定和PCR鉴定.ECV-304细胞株进行常规培养,用电转染技术将重组质粒或空质粒分别转染人ECV-304细胞株,分为CFB-siRNA转染组和空质粒转染组,未转染的细胞为空白对照组.细胞转染后继续培养48 h,于倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（GFP）的表达并计算转染效率;采用半定量逆转录PCR（RT-PCR）法测定各组细胞中CFB mRNA的相对表达量;用MTT法检测各组细胞转染24、48和72 h时细胞的增生值（A）并计算生长抑制率;利用流式细胞技术检测各组细胞的生长周期变化.结果 PCR扩增的目的片段序列与CFB基因序列完全相符,ECV-304细胞转染后,倒置荧光显微镜下可见CFB-siRNA转染组和空质粒转染组的细胞中GFP呈绿色荧光.半定量RT-PCR结果显示,CFB-siRNA转染组、空质粒转染组和空白对照组的CFB mRNA相对表达量分别为0.07±0.04、0.14±0.02和0.14 ±0.03,总体比较差异有统计学意义（F=233.05,P=0.00）;其中CFB-siRNA转染组CFB mRNA相对表达量明显低于空质粒转染组和空白对照组,差异均有统计学意义（均P＜0.05）.MTT法检测结果显示,各组不同时间细胞增生抑制率总体比较差异有统计学意义（F分组=212.99,P=0.00）;CFB-siRNA转染组细胞转染24、48、72 h后细胞增生的抑制率分别为（23.45±0.01）％、（33.48±0.02）％和（45.49±0.01）％,明显高于同时间点空质粒转染组和空白对照组,差异均有统计学意义（均P＜0.05）.流式细胞仪检测结果显示,CFB-siRNA转染组、空质粒转染组和空白对照组G1期的细胞数占总细胞数的（44.4±0.5）％、（25.8±0.4）％和（27.9±0.6）％,总体比较差异有统计学意义（F=58.98,P=0.00）;CFB-siRNA转染组G1期和G2期细胞所占百分比显著高于空白对照组和空质粒转染组,差异均有统计学意义（均P＜0.05）.结论 重组质粒pRNAT-U6.1/CFB siRNA可通过将细胞阻滞在G1期而有效抑制人脐静脉内皮细胞的增生.