pSilencer 1.0-U6-Ang2/Tie2-siRNA重组质粒的构建及其对体外血管生成的作用

摘要

目的：探讨应用RNA干扰(RNAi)技术沉默Ang2、Tie2基因使其在体外抑制血管生成的研究，为将来进一步进行抑制肿瘤血管生成的动物实验研究奠定基础，为肿瘤的基因治疗提供实验依据。 方法： 1、以Ang2、Tie2的mRNA已知序列为靶点，构建PSilencer1.0-U6-siRNA-Ang2/Tie2-siRNA重组质粒各2条。 2、pSilencer1.0-U6-Ang2/Tie2-siRNA重组质粒通过脂质体介导转染人脐静脉内皮细胞(HUVECs)，采用免疫细胞化学染色和RT-PCR检测各组HUVECs中Ang2和Tie2的mRNA及蛋白的表达状况。 3、应用体外血管生成的三维培养模型研究pSilencer l.0-U6-Ang2/Tie2-siRNA重组质粒转染后的HUVECs在体外形成血管样结构的情况。 结果： 1、成功构建pSilencer1.0-U6-Ang2/Tie2-siRNA重组质粒各2条，并且应用限制性内切酶HindⅢ进行消化，证实重组质粒不能被消化；测序结果与设计的完全相符。 2、pSilencer1.0-U6-Ang2/Tie2-siRNA重组质粒转染HUVECs后，免疫细胞化学染色和RT-PCR检测结果显示，Ang2及Tie2在蛋白和mRNA的表达水平均受到明显抑制(P<0.05)，并且两个siRNA的2条重组质粒之间均无明显差别(P>0.05)。 3、pSilencer1.0-U6-Ang2/Tie2-siRNA重组质粒转染后的HUVECs在体外三维培养模型中血管样结构形成的数量和长度均明显减少(P<0.05)，表明血管生成受到明显抑制。 结论： 1、成功构建pSilencer1.0-U6-Ang2/Tie2-siRNA重组质粒。 2、Ang2-siRNA、Tie2-siRNA在体外能够抑制HUVECs的Ang2和Tie2的蛋白及mRNA的表达，从而在体外抑制血管生成。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词表

声明

前言

第一部分pSilencer1.0-U6-Ang2/Tie2-siRNA重组质粒的构建与鉴定

一、材料与试剂

二、实验方法

三、结果

四、讨论

五、结论

第二部分pSilenter1.0-U6-Ang2/Tie2-siRNA重组质粒干预人脐静脉内皮细胞的体外实验研究

一、材料与试剂

二、实验方法与步骤

三、结果

四、讨论

五、结论

参考文献

攻读学位期间发表论文情况

综述 Ang/tie2体系与血管形成的关系

致谢