胚胎干细胞微环境增强人角膜缘干细胞的干性和抑制凋亡的机制

摘要

背景 成体干细胞的命运与其生存的微环境密切相关.研究表明,胚胎干细胞（ESCs）微环境能增强人角膜缘干细胞（LSCs）的干性,其作用机制是研究热点. 目的 探讨干细胞微环境增强LSCs的干性及其抑制细胞凋亡的分子机制.方法将129小鼠ES细胞株（E14细胞）分别用CnT-20培养液和CnT-20＋体积分数20％ ES（ESC-CM）培养液进行培养和传代.采用新鲜供体人角膜缘组织块培养法,分别用CnT-20培养液和ESC-CM培养液培养和传代LSCs,细胞经固定后于光学显微镜下观察细胞克隆形态并计算克隆形成率（CFE）.ESC-CM培养组细胞分别转染端粒酶逆转录酶（TERT） siRNA（19-25nt siRNA）或siRNA（sc37007）,流式细胞仪检测转染前后细胞凋亡、线粒体膜电位的改变;采用免疫荧光技术和流式细胞技术检测siRNA转染前后细胞中端粒酶的表达和活性氧簇（ROS）的产生情况;采用RT-PCR、免疫荧光技术和Western blot法检测细胞中干细胞标志物p63、三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2（ABCG2）、整合素β1（integrin β1）和细胞分化标志物细胞角蛋白3（CK3） mRNA及其蛋白的表达;采用Western blot法检测细胞中黏着斑激酶（FAK）、Akt和糖原合成酶激酶3β（GSK3β）及其磷酸化蛋白以及p21蛋白的改变. 结果 ESC-CM培养组LSCs可传至第8代,CFE为（7.6±0.6）％,CnT-20培养组传至第6代,CFE为（5.6±0.6）％,差异有统计学意义（t=4.454,P=0.011）;ESC-CM培养组第2、3、4、5、6代LSCs的凋亡百分比均明显低于CnT-20培养组,差异均有统计学意义（均P＜0.05）;siRNA-F转染细胞的凋亡率为（7.7±1.3）％,明显低于siRNA-TERT转染细胞的（32.3±3.1）％,差异有统计学意义（t=-12.588,P=0.000）.ESC-CM培养组与CnT-20培养组的原代LSCs 中干细胞标志物mRNA及其蛋白、TERT蛋白的相对表达量差异均无统计学意义（均P＞0.05）,但ESC-CM培养组CK3 mRNA及其蛋白的相对表达量均明显低于CnT-20培养组,差异均有统计学意义（均P＜0.01）;ESCCM培养组第2代细胞中干细胞标志物蛋白及TERT蛋白表达量均明显高于CnT-20培养组,差异均有统计学意义（均P＜0.01）.siRNA-TERT转染组细胞端粒酶活性为（4.83±0.67）％,明显低于siRNA-F转染组的（46.71±1.22）％,差异有统计学意义（t=52.116,P=0.000）.ESC-CM培养组培养液中添加了FAK抑制剂和GSK3β抑制剂以及转染TERT-siRNA后,细胞中pFAK、pAkt、pGSK3β的表达明显减弱,而p21的表达增强.ESC-CM培养组第2代LSCs及siRNA-F转染组细胞的线粒体膜电位明显高于CnT-20培养组和siRNA-TERT 转染组,差异均有统计学意义（均P＜0.01）;ESC-CM培养组原代和第2代细胞中及siRNA-F转染组细胞中ROS表达比例均明显低于CnT-20培养组及siRNA-TERT转染组,差异均有统计学意义（均P＜0.01）. 结论 ESC-CM培养体系可促进LSCs干性的维持,抑制细胞凋亡,其机制可能与端粒酶-p21-线粒体通路及FAK/Wnt 信号通路的激活有关.