结膜下注射间充质干细胞对大鼠角膜移植物生存的影响

摘要

背景 间充质干细胞（MSCs）已用于多种器官移植抗排斥反应的基础和临床研究.我们先前的研究表明,鼠尾静脉注射MSCs可延长大鼠角膜植片的存活时间,但治疗时MSCs的需求量较大且存在一定的全身不良反应.眼局部应用MSCs是否能够替代角膜移植排斥反应的全身治疗尚不清楚. 目的 探讨结膜下注射骨髓MSCs对大鼠角膜移植排斥反应的作用.方法 从清洁级Wistar大鼠股骨和胫骨骨髓中分离获得MSCs进行培养和传代,以体外成骨细胞分化和脂肪细胞分化法进行鉴定,取第3代MSCs用于实验.将20只Wistar大鼠双眼角膜作为角膜供体植片,40只Lewis大鼠右眼作为受体植床,行同种异体穿透角膜移植术.应用随机数字表法将40只受体大鼠分为PBS对照组和MSCs治疗组,另取6只正常Lewis大鼠作为正常对照组.MSCs治疗组大鼠分别于角膜移植术后即刻和第3天结膜下注射含2＆#215;106 MSCs的PBS 0.1 ml,PBS对照组大鼠以同样的方法仅给予等容积PBS.各组大鼠术后每天裂隙灯显微镜下观察角膜植片的混浊、水肿和新生血管情况,并按角膜植片排斥反应标准进行评分.于术后第10天分别处死PBS对照组和MSCs治疗组各12只大鼠,取出术眼角膜组织,采用实时荧光定量PCR法检测Th1细胞相关炎性因子γ干扰素（IFN-γ）mRNA和白细胞介素-2（IL-2）mRNA及Th2细胞相关炎性因子IL-4 mRNA和IL-10 mRNA在角膜中的相对表达量;采用ELISA法检测角膜组织中Th2细胞相关因子IL-4和IL-10蛋白的质量浓度. 结果 培养的细胞生长良好,成骨细胞分化的细胞茜素红染色呈橘黄色,脂肪细胞分化的细胞油红O染色呈红色,证实为MSCs.角膜移植术后MSCs治疗组角膜植片存活时间为（11.8±1.6）d,长于PBS对照组的（9.6±1.4）d,差异有统计学意义（P=0.004）;MSCs治疗组大鼠角膜植片中IFN-γmRNA、IL-2 mRNA的相对表达量较PBS对照组下降,但2个组间差异均无统计学意义（均P＞0.05）,但IL-4 mRNA和IL-10 mRNA相对表达量明显高于PBS对照组,差异均有统计学意义（均P=0.00）.正常对照组、PBS对照组和MSCs治疗组大鼠角膜植片中IL-10蛋白质量浓度分别为（22.74±7.06）、（68.40±12.83）和（215.41±44.66） pg/ml,3个组间总体比较差异有统计学意义（F=55.06,P=0.00）,且MSCs治疗组大鼠植片中IL-10蛋白质量浓度明显高于PBS对照组及正常对照组,差异均有统计学意义（均P＜0.05）.结论 结膜下注射MSCs可以延长大鼠异体穿透角膜移植术后植片的存活时间,这一作用可能是通过调节Th 1/Th2平衡,特别是上调Th2细胞因子而介导的.