结膜下注射间充质干细胞对大鼠角膜移植排斥作用的研究

摘要

目的:
　　角膜移植是许多不可逆角膜损伤及某些先天性角膜病变患者脱盲的唯一治疗途径，角膜移植排斥反应是影响角膜植片存活及高危角膜移植失败的最主要原因。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有调节多种免疫细胞（包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞以及树突状细胞）增殖和功能的作用。在前期研究中我们发现，鼠尾静脉注射MSCs可以抑制角膜移植排斥反应的发生，延长角膜植片的存活时间。在此基础上，本研究仍采用大鼠同种异体大鼠角膜移植排斥动物模型，通过不同时间点结膜下注射MSCs，观察MSCs对角膜移植排斥反应的影响，并初步研究MSCs抑制角膜移植排斥反应的可能调控机制，为MSCs治疗角膜移植排斥反应探索新的方法和途径。
　　方法:
　　1.原代培养Wistar大鼠MSCs，达90％融合时传代培养。用流式细胞仪检测培养细胞的表型，并做体外诱导分化实验。第3代细胞以备后续实验使用。
　　2.制作大鼠角膜移植动物模型，随机分为4组。
　　A组:对照组，给予等量不含药物的PBS。
　　B组:术前结膜下注射MSCs治疗组。
　　C组:术后一次结膜下注射MSCs治疗组。
　　D组:术后两次结膜下注射MSCs治疗组。
　　裂隙灯下对角膜植片进行临床观察，以混浊、水肿和新生血管3项指标作为临床评估标准，比较各组角膜植片的平均存活时间。
　　3.角膜移植模型建立后10天，收集A、D组大鼠右侧眼球（术眼），进行角膜组织病理HE染色和免疫组织化学CD4+T细胞染色。
　　4.角膜移植模型建立后第7天、10天，分别收集A、D组大鼠角膜组织提取总RNA，实时PCR检测细胞因子IFN-γ、 IL-2、IL-4、IL-10的表达情况。
　　5.角膜移植模型建立后第10天，分别收集A、D组角膜组织，角膜组织提取总蛋白，采用ELISA试剂盒检测角膜组织中细胞因子IL-4、IL-10的分泌情况。
　　结果:
　　1.成功分离、培养并鉴定了MSCs，MSCs呈间质细胞特性:梭形，漩涡状排列。茜素红染色、油红染色贴壁细胞分别呈骨样细胞及脂肪样细胞分化。
　　2.成功建立大鼠角膜移植动物模型。
　　3.结膜下注射MSCs治疗角膜移植术后大鼠，术前MSCs注射组（B组）（8.0±0.9）天较对照组（A组）（9.8±1.2）天缩短了植片存活时间(p＜0.05);术后一次注射MSCs治疗组（C组）(10.8±1.3)天与A组相比差异无统计学意义(p＞0.05);术后两次注射MSCs治疗组（D组）角膜植片的存活时间（12.6±1.4）天与A组相比显著延长(p＜0.05)。
　　4.角膜移植术后10天，角膜组织HE染色结果显示，A组角膜植片水肿、增厚，可见大量中性粒细胞、淋巴细胞等炎性细胞浸润，大量新生血管、淋巴管存在。免疫组化可见大量CD4+T细胞在角膜植床和植片基质内。D组角膜植片轻度水肿，基质轻度增厚，少量中性粒细胞、淋巴细胞浸润，部分新生血管、淋巴管长入。CD4+T细胞散在分布，浸润程度较A组减轻。
　　5.Real-time PCR结果显示，角膜移植术后7天，D组大鼠角膜植片中IFN-γ的mRNA表达水平较A组降低(p＜0.05)，Th2细胞因子IL-4和IL-10的mRNA水平升高(p＜0.05);术后10天，D组大鼠角膜植片中IL-4、IL-10的mRNA水平仍显著升高(p＜0.05)，但Th1细胞因子IFN-γ、 IL-2的表达有下调趋势(p＞0.05)。
　　6.角膜组织ELISA结果显示，角膜移植术后10天，D组角膜植片中IL-10的含量较A组及正常组显著增高(p＜0.05); IL-4的蛋白绝对含量较低，且各组差异无统计学意义(p＞0.05)。
　　结论:
　　结膜下注射MSCs可以延长大鼠同种异体穿透性角膜移植植片的存活时间，抑制免疫排斥反应的发生。这一作用可能是通过抑制CD4+T细胞的免疫应答和浸润、调节Th1/Th2平衡，特别是上调Th2细胞因子IL-10而介导的。

目录

声明

摘要

缩略语／符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

1．1 实验动物与材料

1．1．1实验动物

1．1．2 实验所用的主要仪器和设备

1．1．3 主要试剂及溶液配制

1．2 方法

1．2．1 MSCs原代培养

1．2．2 MSCs传代、纯化和扩增

1．2．3 MSCs的冻存与复苏

1．2．4 MSCs的鉴定

1．2．5 角膜移植动物模型制备

1．2．6 动物模型的分组与治疗

1．2．7 临床观察及评分

1．2．8 角膜植片组织病理学染色

1．2．9 角膜组织免疫组织化学染色

1．2．10 角膜组织总RNA提取

1．2．11 角膜组织总RNA逆转录

1．2．12 实时定量PCR(RT-PCR)

1．2．13 角膜组织总蛋白的提取

1．2．14 ELISA检测细胞因子的分泌

1．2．15 统计学处理

1．3 结果

1．3．1 MSCs的培养与鉴定

1．3．2 角膜移植术后临床观察情况

1．3．3 大鼠角膜植片存活情况比较

1．3．4 角膜植片HE及免疫组织化学染色结果

1．3．5 角膜植片Th1、Th2细胞因子mRNA表达比较

1．3．6 角膜植片中细胞因子IL-4、IL-10蛋白含量的比较

1．4 讨论

1．4．1 MSCs的培养与鉴定

1．4．2 MSCs的输注途径

1．4．3 MSCs的输注时间

1．4．4 MSCs的输注剂量

1．4．5 MSCs的免疫学特点和免疫抗炎作用

1．4．6 MSCs对角膜移植排斥反应的抑制作用

1．4．7 MSCs调节辅助性T细胞

1．4．8 MSCs上调IL-10

1．4．9 不足之处

1．5 小结

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述 间充质干细胞在角膜损伤及角膜移植中的应用

致谢