狂犬病毒TaqMan PCR检测方法的建立

摘要

目的 建立检测狂犬病毒(RV)核蛋白(N)基因片段的TaqMan PCR检测方法.方法 针对RV N基因保守区域设计特异性引物与探针;优化检测体系中引物与探针的浓度;以体外转录的RV完整的N基因RNA作为定量分析模型;考核检测体系灵敏性、特异性、稳定性;初步用于RV的检测.结果 引物和探针具有良好的特异性,使用浓度分别为0.6μmol/L和0.2μmol/L,可检测到2700个RNA拷贝数,较传统RT-PCR检测方法敏感性提高了10倍;同一样品Ct值重复检测5次,变异系数均＜5%,表明检测体系具有较好的稳定性;通过所建立的检测体系,绘制了以模板拷贝数为分析指标的RV定量检测标准曲线,对实验室内保存毒株的检测结果显示TaqMan PCR检测比普通PCR检测更快捷、敏感.结论 所建立的RV TaqMan PCR可以用于RV的实验室检测,并且比普通PCR检测方法更灵敏、特异.