猪伪狂犬病毒PCR结合核酸斑点杂交检测方法的建立及山东部分猪场猪伪狂犬病毒流行病学调查

摘要

由猪伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus, PRV）引起的猪伪狂犬病（Pseudorabies, PR）。主要症状为发热、奇痒和脑脊髓炎。患病猪、隐性感染猪、带毒鼠类等都可传播该病毒，同时该病的传播途径很多，传染性很强，给国内外的养猪行业造成了严重的经济损失。近年来，猪伪狂犬病的诊断方法和综合防控措施不断创新，基因缺失苗尤其是gE基因缺失疫苗的免疫是我国当前防控该病的主要措施。因此鉴别诊断gE基因缺失疫苗株和野毒感染，对于该病的防控和净化具有重要意义。 本研究根据NCBI上已发表的PRV的gE基因核酸序列，分别设计和合成了两对引物PRV-F1/R1和PRV-F2/R2。PRV-F1/R1用于制备探针，PRV-F2/R2用于常规PCR检测和质粒标准品的制备。我们先用引物PRV-F2/R2建立PCR检测方法，并对PCR方法的最佳反应条件进行摸索，得到其最佳引物浓度和最佳退火温度。然后用建立的PCR方法扩增1049 bp的片段大小，将此片段克隆到pMD18-T载体上，构建重组质粒，命名为PRV-gE。以质粒PRV-gE为模板，利用引物PRV-F1/R1，标记PRV的gE基因DIG标记核酸探针。首先提取待检测样品的DNA，应用引物PRV-F2/R2对待检测样品的DNA进行扩增，然后将PCR扩增产物点于尼龙膜上，用合成的探针进行斑点杂交检测。运用建立的PCR和PCR结合核酸斑点杂交方法对常见猪病进行检测，检测这两种方法的特异性。将质粒PRV-gE进行定量后作倍比稀释，分别以稀释的质粒作为模板进行PCR和PCR结合核酸斑点杂交方法进行检测，以比较这两种方法的灵敏性。结果显示，PCR检测中只有PRV核酸可扩增出目的条带，PCR结合核酸斑点杂交方法中，探针只与PRV的PCR产物反应呈阳性，表明本研究建立的PCR结合核酸斑点杂交检测方法具有很好的特异性；同时，PCR结合核酸斑点杂交方法灵敏性可以达到10 pg/μL，是单纯PCR （1 ng/μL）的100倍，说明本研究建立的方法具有很好的灵敏性。 然后，采集山东部分地区不同猪场病料共计53份，提取病料的DNA，分别运用PCR和PCR结合核酸斑点杂交的方法进行检测。结果，PCR方法检出4份阳性，阳性率为7.55%，PCR结合核酸斑点杂交方法检出5份阳性，阳性率为9.43%，比单纯PCR检出率高。说明本研究建立的PCR结合核酸斑点杂交的检测方法在临床样品的检测中效果良好，适用于临床检测，更重要的是相对于单纯电泳检测其特异性更强。此外根据NCBI上已发表的PRV gE、TK核酸序列，设计引物，分别用于扩增PRV gE和TK基因, 进行测序，测序结果与NCBI上已发表毒株序列进行比对分析。结果表明，本研究鉴定的5株PRV gE基因核苷酸与亚洲株同源性高于欧美株，gE基因氨基酸比对，我们发现了本研究鉴定的5株毒株以及变异毒株在第48位和495位存在一个天冬氨酸的插入。 此外，我们运用ELISA方法，对山东地区22个猪场的478份血清样品进行PRV-gE抗体检测，结果检出254份阳性，阳性率为53.1%，表明很多猪场存在着PRV野毒株的感染，对山东地区的猪伪狂犬病的流行和发病情况有了进一步的了解。

目录

声明

符号说明

前言

1.1猪伪狂犬病的研究进展

1.2猪伪狂犬病流行病学

1.3猪伪狂犬病的诊断

1.4 猪伪狂犬疫苗研究进展

1.5猪伪狂犬病的防制

1.6斑点杂交检测方法的原理和应用

1.7研究目的及意义

材料与方法

2.1试验材料

2.2试验方法

结果与分析

3.1 PCR检测方法的建立

3.2 PCR结合核酸斑点杂交检测方法的建立

3.3 gE和TK基因序列分析

3.4 山东地区猪场样品gE抗体检测结果

讨论

4.1猪伪狂犬病毒PCR结合核酸斑点杂交检测方法的建立

4.2 PCR结合核酸斑点杂交检测在临床样品检测中的应用与流行毒株序列分析

4.3山东地区猪场样品gE抗体检测

结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文情况