TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR联合检测难辨梭菌菌属基因及毒素基因方法学的建立

摘要

目的建立一种简便、快速难辨梭菌菌属鉴定及其毒素基因筛查的荧光定量PCR检测方法。方法采用TaqMan-MGB探针,通过real-time PCR分析系统,同时检测难辨梭菌菌属基因磷酸丙糖异构酶（Tpi）、A毒素（TcdA）、B毒素（TcdB）及缺失部分基因的A毒素（TcdAT）,从特异度、灵敏度及其抗干扰性等方面评价该方法,并联合全自动酶联荧光免疫系统（VIDAS）检测50例临床不明原因腹泻病例粪便标本探讨其应用价值。结果难辨梭菌非产毒株Tpi基因（tpi）的检测下限是6×10-2CFU/μl,产毒株tpi、tcdA、tcdB、tcdAT的检测下限为6×10-1CFU/μl;难辨梭菌非产毒株tpi检测下限批内、批间变异率分别为2.1%和2.3%;产毒株tpi、tcdA、tcdB、tcdAT的检测下限批内、批间变异率依次为3.0%和3.4%、2.9%和3.2%、5.3%和5.7%、2.7%和2.8%。临床常见分离菌株及梭菌属其他细菌对检测无干扰。50例不明原因腹泻病例粪便标本中,采用TaqMan-MGB探针实时荧光PCR与VIDAS酶标免疫检测39例阴性标本其符合率为100%;6例两方法检测均为阳性;3例VIDAS酶标免疫检测为可疑及2例为阴性,经TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测为A-/B+菌株。结论建立的TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR具有高通量、高灵敏度和重复性好的特性,且可筛查携带缺失部分基因的TcdA难辨梭菌菌株。