miR-320b靶基因预测与鉴定

摘要

目的寻找miR-320b靶基因,探讨其参与T2DM发生发展的分子机制。方法4种在线软件Target Scan、MIRDB、DIANA TOOLS和miRmap预测miR-320b靶基因。采用在线软件VENNY2.1选取4种预测结果交集。在线数据库String查询靶基因编码蛋白质间的相关性,筛选其候选靶基因。采取全基因合成方式合成野生型及突变型靶基因双荧光素酶重组Psicheck-2质粒载体,Sanger测序鉴定重组质粒是否构建成功。选取对数生长期293T细胞分为6组:野生型质粒+miRNA阴性对照组(Psicheck2-PTEN-WT+NC)和野生型质粒+miR-320b mimic组(Psicheck2-PTEN-WT+mimic);突变型质粒+miRNA阴性对照组(Psicheck2-PTEN-Mut+NC)和突变型质粒+miR-320b mimic组(Psicheck2-PTEN-Mut+mimic);空质粒载体+miRNA阴性对照组(Psicheck2-NC+NC)和空质粒载体+miR-320b mimic组(Psicheck2-NC+mimic)。各组进行相应质粒和miRNAs共转染,检测双荧光素酶活性。结果4种在线软件Target Scan、MIRDB、DIANA TOOLS和miRmap预测miR-320b靶基因数分别为847、1045、806和6208,VENNY2.1取交集后得到66个共同靶基因。在线数据库String显示,66个靶蛋白之间的相关性主要集中在以人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物(PTEN)为核心的蛋白。双荧光素酶报告基因实验显示,Psicheck2-PTEN-WT+miR320b组荧光素酶活性比值低于Psicheck2-PTEN-WT+NC组(P<0.05)。结论miR-320b作用于靶基因PTEN的3’UTR,为探讨miR-320b参与T2DM发生发展提供依据。