马立克病病毒编码的miR-M12-5p/3p宿主靶基因预测、筛选与鉴定

摘要

马立克病(Marek's disease，MD)是由马立克病病毒(Marek's disease virus，MDV)引起的鸡的以T细胞淋巴肿瘤为主要特征的免疫抑制病与肿瘤病。MD是目前已知的首个可以通过疫苗免疫来预防的由病毒引起的肿瘤病，且其具有极其典型的肿瘤发生发展的动力学过程，因此MDV为研究病毒编码的miRNA引起机体肿瘤发生发展提供了天然的病毒-宿主互作模型。此前研究发现MDV-1编码的Meq基因簇内各miRNA前体单基因缺失的MDV毒株感染后，鸡的死亡率和肿瘤发生率显著降低，表明Meq基因簇的miRNA可能具有调控MDV致病表型的功能。其中，与miR-M2、miR-M3、miR-M4、miR-M9以及miR-M5前体单基因缺失株相比，miR-M12前体单基因缺失株的作用最强，预示miR-M12编码的成熟miRNA可能在MD肿瘤发生发展过程中起到了重要的调节作用。
　　为了进一步揭示miR-M12编码的成熟体miR-M12-5p和miR-M12-3p在MD肿瘤发生中的作用。首先利用生物信息学软件RNAhybrid预测miR-M12-5p和miR-M12-3p的候选宿主靶基因，结果从45个下调表达的基因中共预测出14个候选靶基因，其中19个结合位点位于3'-UTR;然后挑选出7个候选靶基因共9个结合位点进行试验验证。构建含有候选靶基因mRNA-3'-UTR结合位点的psiCHECKTM-2报告基因重组载体和含有miR-M12前体的pcDNA62重组载体，共转染HEK293T细胞，利用双萤光素酶报告基因检测试剂盒检测miR-M12-5p和miR-M12-3p是否与候选靶基因mRNA-3'-UTR发生体外相互作用。结果表明miR-M12-5p可以靶向识别氢离子电压门控通道1（Hydrogen voltage gated channel1，HVCN1）基因的3'-UTR结合位点;miR-M12-3p可以靶向识别70kDa热休克蛋白4（Heat shock70kDa protein4，HSPA4）基因的3'-UTR结合位点。进一步分别将miR-M12-5p和miR-M12-3p的种子区以及HVCN1和HSPA4的结合位点进行人为突变，验证miRNA:mRNA的相互作用是否具有位点特异性。结果表明miRNA种子区突变后，mut-miR-M12-5p不能抑制psiCHECK-2-HVCN1-3'-UTR的海肾萤光素酶活性，mut-miR-M12-3p不能抑制psiCHECK-2-HSPA4-3'-UTR的海肾萤光素酶活性;HVCN1结合位点突变后，miR-M12-5p不能抑制psiCH ECK-2-mut-HVCN1-3'-UTR的海肾萤光素酶活性，HSPA4结合位点突变后，miR-M12-3p不能抑制psiCHECK-2-mut-HSPA4-3'-UTR的海肾萤光素酶活性。此结果表明miR-M12-5p和miR-M12-3p分别抑制HVCN1和HSPA4的表达主要通过特定结合位点发生作用。最后通过miR-M12前体单基因缺失株感染CEF细胞，进一步检测miRNA在体内病毒感染时对候选靶基因mRNA表达水平的调控。实时荧光定量PCR结果表明:miR-M12-5p可以下调HVCN1mRNA的表达;miR-M12-3p可以下调HSPA4mRNA的表达。上述研究结果表明，miR-M12-5p可以靶向调节宿主基因HVCN1的表达;miR-M12-3p可以靶向调节宿主基因HSPA4的表达。
　　本研究通过生物信息学预测及试验验证的方法，研究发现miR-M12-5p可以下调HVCN1mRNA的表达;miR-M12-3p可以下调HSPA4mRNA的表达。本研究为进一步揭示miR-M12编码的miRNA调控MDV致病及致瘤的分子机制奠定了基础。

目录

论文说明

声明

致谢

摘要

第一部分 文献综述

1 马立克病病毒研究进展

1．1 马立克病

1．2 马立克病病毒及其致病机制

2 microRNA研究进展

2．1 microRNA的发现

2．2 microRNA的生物合成与作用机制

2．3 microRNA的功能

3．1 马立克病病毒microRNA的发现

3．2 马立克病病毒microRNA的调控机制

3．3 马立克病病毒microRNA的功能

4 本研究的目的意义

第二部分 研究内容

2 材料与方法

3 结果与分析

4 讨论

第二章 miR-M12-5p／3p宿主靶基因筛选与鉴定

1 引言

2 材料与方法

3 结果与分析

4 讨论

第三章 miR-M12-5p／3p宿主靶基因的体内验证

1 引言

2 材料与方法

3 结果与分析

4 讨论

全文总结

参考文献