抑癌基因DKK3过表达抑制人皮肤黑素瘤细胞迁移和侵袭的机制探讨

摘要

目的探讨DKK3在人皮肤恶性黑素瘤细胞及组织中的表达及转染DKK3对人黑素瘤细胞A375迁移与侵袭的影响。方法通过Western印迹法分析DKK3在人黑素瘤细胞系（HM、A375、WM451、SK-MEL-1、Hs-695T、MDA-MB-435s、WM35）及色素痣细胞中的表达, 实时荧光定量PCR检测2014年8月至2017年6月在重庆市中医院皮肤科收集的58例恶性黑素瘤（包括原发性黑素瘤与转移性黑素瘤）和30例色素痣组织中DKK3 mRNA的相对表达水平。分别转染pcDNA3.1（+）-Flag-Vector质粒（对照组）和pcDNA3.1（+）-Flag-DKK3质粒（转染组）至恶性黑素瘤A375细胞中, 通过实时荧光定量PCR和Western印迹法验证DKK3的过表达, 及DKK3过表达对黑素瘤细胞迁移和侵袭相关的分子表达水平的影响;通过细胞平板划痕实验、Transwell迁移和侵袭实验分析DKK3对A375细胞迁移及侵袭的影响。采用SPSS 13.0软件进行统计学分析, 两独立样本间的比较采用t检验;多组数据的比较采用单因素方差分析, 组间两两比较采用LSD-t检验。结果 DKK3蛋白在人黑素瘤细胞系中表达缺失或低表达, 在色素痣组织中高表达。原发性黑素瘤、转移性黑素瘤与色素痣中DKK3 mRNA表达水平（2-ΔΔCt）分别为（0. 325 ± 0.150）× 10-3、（0. 142 ± 0.210）× 10-3、（0. 634 ± 0.120）× 10-3, 差异有统计学意义（F = 46.57, P ＆ 0.05）, 转移性黑素瘤表达水平低于原发性黑素瘤和色素痣（LSD-t分别为2.48、3.12, 均P ＆ 0.05）。A375细胞转染DKK3后, 细胞划痕迁移率（22.11% ± 5.11%）低于对照组（54.36% ± 23.22%）（t= 2.36, P ＆ 0.001）;迁移及侵袭实验中, 转染组穿出小室细胞数（265 ± 33、76 ± 18）低于对照组（429 ± 41、135 ± 21）, 差异有统计学意义（t值分别为1.24、1.35, 均P ＆ 0.001）。转染组A375细胞过表达DKK3后, 上皮钙黏着蛋白和mRNA表达上升, 神经钙黏着蛋白、波形蛋白、基质金属蛋白酶2（MMP2）、MMP7、MMP11蛋白和mRNA的表达下降。结论 DKK3在黑素瘤细胞系和组织中表达下调, DKK3过表达后A375细胞的迁移和侵袭受到明显抑制, DKK3可能是抑制皮肤恶性黑素瘤转移的靶点。