人GJB6基因Tet-on HaCaT细胞稳定株的构建与鉴定

摘要

目的以Tet-on慢病毒为载体建立稳定表达GJB6基因及其突变体的HaCaT细胞株, 为后续研究有汗性外胚层发育不良的发病机制奠定实验基础。方法利用PCR技术扩增人GJB6基因野生型与突变型（A88V）基因, 重组Tet-on慢病毒质粒, 经基因测序及酶切技术对其鉴定, 再将重组慢病毒转染入HaCaT细胞, 经嘌呤霉素筛选出稳定表达编码缝隙连接蛋白Cx30的GJB6基因的细胞株。细胞株加四环素诱导后, 通过RT-PCR检测GJB6基因的mRNA表达量, 同时通过Western印迹检测Cx30与FLAG标签肽的表达, 从而对稳定表达GJB6基因的HaCaT细胞株进行鉴定。用CCK8法检测GJB6基因野生型与突变型经四环素诱导表达后对细胞增殖的影响。结果经酶切、测序鉴定, 重组慢病毒质粒构建成功。RT-PCR检测到稳定转染的HaCaT细胞中GJB6基因mRNA表达量明显增加, 感染野生型Tet-on慢病毒的HaCaT细胞组（WT组）加四环素GJB6基因表达丰度是WT组不加四环素的113.369倍（P＆ 0.05）, 感染突变型（A88V） Tet-on慢病毒的HaCaT细胞组（MU组）加四环素GJB6基因表达丰度是MU组不加四环素的3.249倍（P＆ 0.05）;Western印迹可检测到经四环素处理的WT组和MU组稳定表达Cx30与FLAG, 而未经四环素处理的细胞和感染阴性对照病毒的HaCaT细胞组（NC组）未检测到Cx30与FLAG目的条带。NC组加与不加入四环素在4、8、12、24、36、48 h时的A值差异均无统计学意义（P＆ 0.05）;WT组加与不加入四环素在4、8、12、24、36 h时的A值差异均有统计学意义（P＆ 0.05）;MU组加与不加入四环素在4、8、12、24、36、48 h时的A值差异均有统计学意义（P＆ 0.05）。结论成功构建出稳定表达GJB6基因野生型及其突变体A88V的HaCaT细胞株。