沉默P2X4R基因对P2X4/NLRP3炎性小体通路介导的BV2小胶质细胞中肿瘤坏死因子α表达的影响

摘要

目的探讨使用慢病毒（LV-P2rx4）沉默P2X4嘌呤受体（P2X4R）对活化状态小胶质细胞释放肿瘤坏死因子α（TNF-α）的影响。方法常规建立脂多糖（LPS）和三磷酸腺苷（ATP）双信号诱导的小胶质细胞活化模型,随机分为（1）空白对照组（常规DMEM培养液培养）;（2）活化模型组（细胞种板后待密度接近80%后先给予LPS 1μg·m L-1处理6 h后弃原培养液,再加ATP 2 mmol·L-1处理3 h）;（3）目的基因阴性对照组（种板1 d,先加入病毒处理12 h后弃培养液,再加入常规培养液,间隔12 h更换培养液）;（4）目的基因阴性对照+活化模型组（种板1 d后,先加入病毒处理12 h后弃培养液,再加常规培养液,期间每隔12 h更换培养液,待细胞密度达80%后,予LPS 1μg·m L-1处理6 h后弃原培养液,再加ATP 2 mmol·L-1处理3 h）;（5）空载病毒阴性对照组（处理方法同目的基因阴性对照组）;（6）空载病毒阴性对照+活化模型组（处理方法同目的基因阴性对照+活化模型组）。各组均n=6。细胞处理后每组取3孔分别提取核糖核酸（RNA）和蛋白,应用Real time PCR和Western blot法分别检测NLRP3、TNF-α的mRNA及蛋白的相对表达。结果与活化模型组和空载病毒阴性对照+活化模型组比较,目的基因阴性对照+活化模型组TNF-αmRNA相对表达水平明显减少（P ＜0. 001,F=195. 4）,TNF-α蛋白相对表达水平显著降低（P ＜0. 001,F=60. 10）。结论沉默小胶质细胞中的P2X4R基因,可下调细胞中TNF-α表达,继而可能削弱小胶质细胞的炎症反应。