自组装核酸适配子探针在深部真菌感染可视化检测中的应用

摘要

目的:建立一种自组装核酸适配子探针技术以实现深部真菌感染中外周血(1,3)-β-D-葡聚糖的可视化检测。方法:用碱酶解法提取白念珠菌(1,3)-β-D-葡聚糖并使用葡聚糖酶体外消化处理,获得的水溶性葡聚糖作为靶标,利用指数富集的配体系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)从单链DNA文库中筛选能够特异性识别并结合葡聚糖的DNA适配子;对筛选出的适配子进行结构设计,使其能够形成含血晶素(hemin)的G四联体结构,从而具有拟过氧化物酶特性,进一步催化TMB底物显色,肉眼判断颜色变化进行结果判读;对149例临床血清标本分别用建立的方法和G试验检测(1,3)-β-D-葡聚糖,评价检测效能。结果:成功提取白念珠菌(1,3)-β-D-葡聚糖并使用葡聚糖酶消化处理后经SDS-PAGE分离、糖原染色发现,其水溶性的(1,3)-β-D-葡聚糖主要分布在相对分子质量<1700、约4600和10000~15000区域。其中相对分子量小于10000的(1,3)-β-D-葡聚糖比例较高,将其作为适配子筛选靶标。经过8轮正向筛选和4轮负向筛选,将最后一轮ssDNA文库扩增为dsDNA并克隆至pUC19质粒,对单个阳性克隆扩增所得适配子进行相对结合力比较,获得6个结合力较高的适配子(命名为A1—A6)。竞争试验结果表明6个适配子能够识别4个不同位点。将高结合力适配子对不同浓度(1,3)-β-D-葡聚糖进行亲和力检测,肉眼可辨检出限为3.125 pg/mL,线性范围为1.6 pg/mL^400 pg/mL。对149例血清(1,3)-β-D-葡聚糖检测结果显示,适配子自组装显色系统检测性能优于G试验(χ^2=4.373,P=0.0365)。结论:成功自建可视化核酸适配子探针,实现外周血(1,3)-β-D-葡聚糖检测,且有望开发深部真菌床旁检测试剂盒。